慢病毒包装所需辅助质粒

慢病毒包装常用于基因编辑和基因治疗研究。慢病毒包装通常需要以下关键质粒（plasmid）：

1. 表达质粒（Transfer Plasmid）

含有目标基因（GOI, gene of interest）的表达框架。

通常包含慢病毒的 5’LTR 和 3’LTR 序列，用于病毒基因组的包装和整合。

常见载体：pLenti 系列、pLV 系列等。

2. 包装质粒（Packaging Plasmid）

提供慢病毒的包装蛋白（如 Gag、Pol、Rev）的编码基因。

这些蛋白是病毒颗粒组装和基因组复制所必需的。

常见的包装质粒：psPAX2（来自第二代慢病毒系统）。

3. 包膜质粒（Envelope Plasmid）

编码包膜蛋白（Env），赋予病毒进入宿主细胞的能力。

最常见的是 pMD2.G，编码水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G），适用于多种细胞类型。

第二代与第三代系统的区别

第二代系统：

使用两种辅助质粒：psPAX2（包装质粒）和 pMD2.G（包膜质粒）。

优势：操作简单，适合大部分实验。

风险：包装和表达功能集中于单一质粒，潜在重组风险略高。

第三代系统：

使用三种辅助质粒：

包装质粒分为两个部分：Gag/Pol 和 Rev 分别提供。

单独的包膜质粒。

优势：安全性更高，适合临床研究。

现在的慢病毒包装系统通常包括几个质粒，这几个质粒上分别含有慢病毒复制的成分，这样做的目的就是为了增加安全性，毕竟如果只用一个成分的话，危险系数很高，人一旦接触这种病毒就有可能遇到危险。而把这几个成分分散在几个质粒中，很难在体外形成危险的病毒颗粒。第二代慢病毒包装系统含有3个质粒，第三代慢病毒

包装系统含有4个质粒。这两代病毒包装系统都含有以下相同的成分：

第一，编码目的蛋白或转录目的基因的转移质粒。其实就是你自己的目的质粒，也就是通常需要自己做载体的质粒。目的基因的两侧都含有长末端重复序列（LTR，long terminal repeat），LTR的作用就是辅助目的基因插入到宿主细胞的基因组。许多慢病毒质粒都是基于HIV-1病毒改造的。为了安全目的，这些目的质粒的复能能力并不完全，它们的3'LTR有所删减，这样病毒插入到基因组后会自我失活（self-inactivating）（SIN）。

第二，包装质粒，毒包装的结构蛋白编码质粒。

第三，包膜质粒，编码蛋白质外壳。

第二代慢病毒利用病毒的LTR启动子用于基因的表达，第三代慢病毒利用一个杂合的LTR启动子进行基因表达。



第二代慢病毒

下图是第二代慢病毒系统：

这个系统含有3个质粒，第1个质粒：包装质粒，它编码Gag，PoI，Rev与Tat基因。第2个质粒：包膜质粒，含有VSV-G，编码蛋白Env。第3个质粒：目的质粒，含有病毒的LTRs和psi包装信号（图片未画出），除非有内部启动子，否则这个目的质粒的目的基因是由5'LTR驱动的，它是一个弱启动子，需要Tat元件 的来激活它。所有的第2代慢病毒目的质粒必须要用第2代慢病毒包装系统，因此它的LTR是Tat依赖性的。

第三代慢病毒

第三代慢病毒如下所示：

设计第3代病毒的目的主要还是提高安全性。在第3代病毒中，将第2代病毒的包装质粒分成了2个质粒，一个编码Rev，另外一个编码Gag和PoI。虽然第3代病毒更加安全了，但是它的效率却降低了。除此之外，第3代病毒删除了Tat元件，并且在目的质粒中引入了一个嵌合了5'LTR的异源启动子。这种目的质粒基因的启动子并不依赖于Tat元件。第3代病毒的目的质粒可以使用第2代或第3代的包装质粒，也就是说第3代慢病毒的目的质粒兼容第2代的包装系统。



第二代慢病毒与第第三代病毒的区别：

第三代病毒包装系统的过程

其实买的目的质粒虽然是三代病毒包装系统的，但是完全可以用二代慢病毒包装系统来替代，用PMD2G和psPAX2，外加目的质粒进行转染。

病毒产生过程：

3-4个质粒共转到A293T细胞：

1个包含有目的基因的转移质粒；

1-2个包装质粒

1个包膜质粒

包膜质粒：pMD2.G       前往下载最新质粒序列    ：   Addgene: pMD2.G

二代包装质粒：psPAX2      前往下载最新质粒序列    ：Addgene: psPAX2

三代包装质粒：

pMDlg/pRRE    前往下载最新质粒序列    ：Addgene: pMDLg/pRRE

pRSV-Rev     前往下载最新质粒序列    ：Addgene: pRSV-Rev