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| 产品货号 | 产品类型 | 装载载体 | 基因信息 | 产品价格 | 出货周期 |
|---|---|---|---|---|---|
| 23 | 慢病毒 CRISPRi 转录抑制载体 | pHR-SFFV-dCas9-BFP-KRAB | pHR-SFFV-dCas9-BFP-KRAB | 280 |
pHR-SFFV-dCas9-BFP-KRAB
pHR-SFFV-dCas9-BFP-KRAB 质粒完整说明
一、基础标识
Addgene 编号：#46911
来源实验室：Stanley Qi、Jonathan Weissman
原始文献：Gilbert et al., Cell, 2013（CRISPRi 奠基文章）
载体类型：HIV-1 慢病毒 CRISPRi 转录抑制载体
全长：14167 bp，骨架 pHR（空载骨架约 9000 bp）
质粒完整图谱
二、命名分段解析
表格
| 片段 | 功能说明 |
|---|---|
| pHR | 经典二代慢病毒骨架，含 LTR、ψ 包装信号、RRE、cPPT，可包装慢病毒侵染多数人源细胞 |
| SFFV | spleen focus-forming virus 强广谱启动子，短片段 (~500 bp)，病毒滴度高，驱动下游融合蛋白持续表达 |
| dCas9 | 失活 Cas9（D10A+H840A 双突变），无 DNA 切割酶活，仅依靠 sgRNA 靶向结合基因组 DNA |
| BFP | TagBFP 蓝色荧光蛋白，流式分选 / 荧光显微镜标记阳性表达 dCas9-KRAB 的细胞 |
| KRAB | Kox1 来源转录抑制结构域，CRISPRi 核心抑制元件 |
融合蛋白完整结构（N→C 端）
dCas9 - HA 标签 - 2×SV40 NLS（核定位信号）- TagBFP - KRAB
HA：免疫荧光 / WB 检测 dCas9 蛋白
双 NLS：保证 dCas9 高效入核结合染色质
BFP：活细胞无创分选标记
KRAB：表观沉默功能模块
三、核心元件功能（CRISPRi 原理）
CRISPRi工作机制
dCas9 靶向定位
sgRNA 引导 dCas9 结合靶基因转录起始位点 TSS 附近，物理阻挡 RNA 聚合酶延伸，轻度抑制转录。
KRAB 强效表观沉默
KRAB 招募 KAP1 (TRIM28)、HP1、组蛋白甲基转移酶，在靶位点富集抑制性修饰H3K9me3，形成异染色质，强效、长效沉默靶基因（抑制倍数可达几十～上百倍）
BFP 筛选优势
无需嘌呤霉素 / 潮霉素等药物筛选，直接通过流式分选 BFP⁺细胞，快速获得稳定表达 CRISPRi 的细胞株，无药物毒性干扰。
四、载体抗性与培养条件
原核抗性：Ampicillin（氨苄青霉素，100 μg/mL）
推荐感受态：Stbl3（慢病毒长片段载体，防止重组缺失）
培养温度：37 ℃，高拷贝 pUC 复制子，质粒产量高
五、适用实验体系
CRISPRi 基因沉默（主流用途）
与 U6-sgRNA 慢病毒 / 转染质粒共转染 / 共侵染，批量沉默编码基因、lncRNA、增强子。
构建稳定 CRISPRi 细胞系
慢病毒包装后侵染肿瘤细胞、干细胞、原代细胞，BFP 分选获得纯阳性池 / 单克隆。
表观抑制机制研究
对比无 KRAB 对照质粒 pHR-SFFV-dCas9-BFP（#46910），区分单纯空间阻挡 vs KRAB 介导表观沉默。
六、优缺点对比
优点
SFFV 启动子表达量高、片段短，慢病毒包装滴度远高于 EF1α 驱动载体；
BFP 荧光标记，活细胞实时分选，无筛选药损伤；
3 KRAB 是哺乳动物最强通用转录抑制域之一，沉默效率极高；
4 慢病毒整合至基因组，可构建长期稳定细胞系。
局限
1 SFFV 在部分干细胞 / 原代细胞中会发生表观沉默；
2 载体较大，共转染效率低于小型 sgRNA 质粒；
3 仅用于基因抑制（CRISPRi），不能用于基因敲除（无 Cas9 切割活性）。
七、配套对照质粒（Addgene 同系列）
#46910 pHR-SFFV-dCas9-BFP：无 KRAB，空白对照，仅物理阻挡转录
#46912 pHR-SFFV-dCas9-VP64-BFP：CRISPR 激活（CRISPRa）对照
八、常规实验流程
扩增质粒：Stbl3 感受态，LB + 氨苄扩增、提质粒；
慢病毒三质粒共转染 293T（pHR-dCas9-KRAB + psPAX2 + pMD2.G）；
收集病毒上清侵染靶细胞；
流式分选 BFP 阳性细胞，获得稳定 CRISPRi 细胞株；
转染 / 侵染对应 sgRNA 载体，检测靶基因 mRNA / 蛋白下调水平。
