pPIC9k-His载体质粒基本信息

pPIC9k-His质粒图谱载体图谱和pPIC9k-His载体序列质粒序列多克隆位点信息

pPIC9k-His质粒载体简介

pPIC9K-His载体中存在卡那抗性基因，允许利用卡那抗性在酵母体内筛选多克隆拷贝，载体其余部分与pPIC9载体完全一样。pPIC9K-His载体能够使用的毕赤酵母宿主菌是KM71和GS115。

pPIC9K-His载体详细信息如下：

• pPIC9K-His载体大小9.3 bp，是融合表达载体, 含有C-His标签，表达出来的蛋白含有C端his标签，可以直接用于镍柱纯化。

• 载体构建过程中，可供使用的单一限制性内切酶位点为SnaB I, EcoR I, Avr II, Not I.

• 利用alpha因子分泌信号肽，分泌表达蛋白基因。

• 在载体构建过程中，你的基因必须保证与信号肽的起始密码子的读码框一致。

• 毕赤酵母中利用HIS4进行筛选。

• 为了将基因插入GS115或KM71的AOX区, 使用Sac I限制性内切酶线性化质粒(GS115中产生His+Mut+基因型，KM71中产生His+ MutS基因型)

•为了将基因插入GS115或KM71的His4区, 使用Sal I或者Stu I限制性内切酶线性化质粒(GS115中产生His+ Mut+基因型，KM71中产生His+ MutS基因型)

•将基因插入GS115的AOX1区域，需要使用Bgl II 线性化质粒 (产生His+MutS基因型)。

pPIC9k-His质粒序列载体序列

LOCUS       pPIC9K-His              9294 bp    DNA     circular     25-DEC-2016

DEFINITION  pPIC9K-His.

SOURCE      

  ORGANISM  other sequences; artificial sequences; vectors.

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            http://www.biofeng.com/

COMMENT     ORIGDB|GenBank

COMMENT     VNTDATE|-11561372|

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COMMENT     LSOWNER|

COMMENT     VNTNAME|pPIC9K-His|

COMMENT     VNTAUTHORNAME|Demo User|

COMMENT     VNTOAUTHORNAME|UNKNOWN|

FEATURES             Location/Qualifiers

     misc_feature    1152..1172

                     /vntifkey="21"

                     /label=alpha_factor_primer

     misc_feature    complement(1345..1365)

                     /vntifkey="21"

                     /label=3_AOX1_primer

     gene            complement(1668..1955)

                     /gene="tet(288-0)"

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     CDS             complement(1998..4532)

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                     /label=HIS4

                     /note="ORF frame 3"

     gene            complement(1998..4532)

                     /gene="HIS4"

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     CDS             complement(4946..5761)

                     /gene="KanR2"

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                     /label=Kana\Resistance

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     gene            complement(4946..5761)

                     /gene="KanR2"

                     /vntifkey="60"

     misc_feature    complement(5926..5945)

                     /vntifkey="21"

                     /label=pBRrevBam_primer

     CDS             complement(5927..6649)

                     /vntifkey="4"

                     /label=ORF\frame\2

     misc_feature    complement(6931..6953)

                     /vntifkey="21"

                     /label=pGEX_3_primer

     rep_origin      complement(7306..7979)

                     /vntifkey="33"

                     /label=pBR322_origin

     CDS             complement(8124..8984)

                     /gene="Ampicillin"

                     /vntifkey="4"

                     /label=Ampicillin

                     /note="ORF frame 3"

     gene            complement(8124..8984)

                     /gene="Ampicillin"

                     /vntifkey="60"

     promoter        complement(9026..9054)

                     /vntifkey="30"

                     /label=AmpR_promoter

     promoter        1..948

                     /vntifkey="29"

                     /label=5'\AOX1\Promoter\Fragment

     primer          855..875

                     /vntifkey="27"

                     /label=5'\AOX1\Primer

     sig_peptide     949..1218

                     /vntifkey="94"

                     /label=alpha\Factor\Secretion\Signal

     misc_feature    1192..1241

                     /vntifkey="21"

                     /label=Multiple\Cloing\Site

     misc_feature    1271..1604

                     /vntifkey="21"

                     /label=3'\AOX1\transcription\termination\(TT)

     misc_feature    6140..6897

                     /vntifkey="21"

                     /label=3'\AOX1\Fragment

     misc_feature    1246..1263

                     /vntifkey="21"

                     /label=His\Tag

BASE COUNT     2499 a      2205 c      2078 g      2512 t 

ORIGIN

        1 agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 

       61 gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 

      121 tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 

      181 agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 

      241 acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 

      301 tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 

      361 agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 

      421 gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 

      481 ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcgcca taccgtttgt 

      541 cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 

      601 ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 

      661 ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 

      721 gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 

      781 atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 

      841 actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 

      901 caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaagga tccaaacgat gagatttcct 

      961 tcaattttta ctgcagtttt attcgcagca tcctccgcat tagctgctcc agtcaacact 

     1021 acaacagaag atgaaacggc acaaattccg gctgaagctg tcatcggtta ctcagattta 

     1081 gaaggggatt tcgatgttgc tgttttgcca ttttccaaca gcacaaataa cgggttattg 

     1141 tttataaata ctactattgc cagcattgct gctaaagaag aaggggtatc tctcgagaaa 

     1201 agagaggctg aagcttacgt agaattccct agggcggccg cgaatcatca tcaccatcac 

     1261 cattaattcg ccttagacat gactgttcct cagttcaagt tgggcactta cgagaagacc 

     1321 ggtcttgcta gattctaatc aagaggatgt cagaatgcca tttgcctgag agatgcaggc 

     1381 ttcatttttg atactttttt atttgtaacc tatatagtat aggatttttt ttgtcatttt 

     1441 gtttcttctc gtacgagctt gctcctgatc agcctatctc gcagctgatg aatatcttgt 

     1501 ggtaggggtt tgggaaaatc attcgagttt gatgtttttc ttggtatttc ccactcctct 

     1561 tcagagtaca gaagattaag tgagaagttc gtttgtgcaa gcttatcgat aagctttaat 

     1621 gcggtagttt atcacagtta aattgctaac gcagtcaggc accgtgtatg aaatctaaca 

     1681 atgcgctcat cgtcatcctc ggcaccgtca ccctggatgc tgtaggcata ggcttggtta 

     1741 tgccggtact gccgggcctc ttgcgggata tcgtccattc cgacagcatc gccagtcact 

     1801 atggcgtgct gctagcgcta tatgcgttga tgcaatttct atgcgcaccc gttctcggag 

     1861 cactgtccga ccgctttggc cgccgcccag tcctgctcgc ttcgctactt ggagccacta 

     1921 tcgactacgc gatcatggcg accacacccg tcctgtggat ctatcgaatc taaatgtaag 

     1981 ttaaaatctc taaataatta aataagtccc agtttctcca tacgaacctt aacagcattg 

     2041 cggtgagcat ctagaccttc aacagcagcc agatccatca ctgcttggcc aatatgtttc 

     2101 agtccctcag gagttacgtc ttgtgaagtg atgaacttct ggaaggttgc agtgttaact 

     2161 ccgctgtatt gacgggcata tccgtacgtt ggcaaagtgt ggttggtacc ggaggagtaa 

     2221 tctccacaac tctctggaga gtaggcacca acaaacacag atccagcgtg ttgtacttga 

     2281 tcaacataag aagaagcatt ctcgatttgc aggatcaagt gttcaggagc gtactgattg 

     2341 gacatttcca aagcctgctc gtaggttgca accgataggg ttgtagagtg tgcaatacac 

     2401 ttgcgtacaa tttcaaccct tggcaactgc acagcttggt tgtgaacagc atcttcaatt 

     2461 ctggcaagct ccttgtctgt catatcgaca gccaacagaa tcacctggga atcaatacca 

     2521 tgttcagctt gagacagaag gtctgaggca acgaaatctg gatcagcgta tttatcagca 

     2581 ataactagaa cttcagaagg cccagcaggc atgtcaatac tacacagggc tgatgtgtca 

     2641 ttttgaacca tcatcttggc agcagtaacg aactggtttc ctggaccaaa tattttgtca 

     2701 cacttaggaa cagtttctgt tccgtaagcc atagcagcta ctgcctgggc gcctcctgct 

     2761 agcacgatac acttagcacc aaccttgtgg gcaacgtaga tgacttctgg ggtaagggta 

     2821 ccatccttct taggtggaga tgcaaaaaca atttctttgc aaccagcaac tttggcagga 

     2881 acacccagca tcagggaagt ggaaggcaga attgcggttc caccaggaat atagaggcca 

     2941 actttctcaa taggtcttgc aaaacgagag cagactacac cagggcaagt ctcaacttgc 

     3001 aacgtctccg ttagttgagc ttcatggaat ttcctgacgt tatctataga gagatcaatg 

     3061 gctctcttaa cgttatctgg caattgcata agttcctctg ggaaaggagc ttctaacaca 

     3121 ggtgtcttca aagcgactcc atcaaacttg gcagttagtt ctaaaagggc tttgtcacca 

     3181 ttttgacgaa cattgtcgac aattggtttg actaattcca taatctgttc cgttttctgg 

     3241 ataggacgac gaagggcatc ttcaatttct tgtgaggagg ccttagaaac gtcaattttg 

     3301 cacaattcaa tacgaccttc agaagggact tctttaggtt tggattcttc tttaggttgt 

     3361 tccttggtgt atcctggctt ggcatctcct ttccttctag tgacctttag ggacttcata 

     3421 tccaggtttc tctccacctc gtccaacgtc acaccgtact tggcacatct aactaatgca 

     3481 aaataaaata agtcagcaca ttcccaggct atatcttcct tggatttagc ttctgcaagt 

     3541 tcatcagctt cctccctaat tttagcgttc aacaaaactt cgtcgtcaaa taaccgtttg 

     3601 gtataagaac cttctggagc attgctctta cgatcccaca aggtggcttc catggctcta 

     3661 agaccctttg attggccaaa acaggaagtg cgttccaagt gacagaaacc aacacctgtt 

     3721 tgttcaacca caaatttcaa gcagtctcca tcacaatcca attcgatacc cagcaacttt 

     3781 tgagttgctc cagatgtagc acctttatac cacaaaccgt gacgacgaga ttggtagact 

     3841 ccagtttgtg tccttatagc ctccggaata gactttttgg acgagtacac caggcccaac 

     3901 gagtaattag aagagtcagc caccaaagta gtgaatagac catcggggcg gtcagtagtc 

     3961 aaagacgcca acaaaatttc actgacaggg aactttttga catcttcaga aagttcgtat 

     4021 tcagtagtca attgccgagc atcaataatg gggattatac cagaagcaac agtggaagtc 

     4081 acatctacca actttgcggt ctcagaaaaa gcataaacag ttctactacc gccattagtg 

     4141 aaacttttca aatcgcccag tggagaagaa aaaggcacag cgatactagc attagcgggc 

     4201 aaggatgcaa ctttatcaac cagggtccta tagataaccc tagcgcctgg gatcatcctt 

     4261 tggacaactc tttctgccaa atctaggtcc aaaatcactt cattgatacc attattgtac 

     4321 aacttgagca agttgtcgat cagctcctca aattggtcct ctgtaacgga tgactcaact 

     4381 tgcacattaa cttgaagctc agtcgattga gtgaacttga tcaggttgtg cagctggtca 

     4441 gcagcatagg gaaacacggc ttttcctacc aaactcaagg aattatcaaa ctctgcaaca 

     4501 cttgcgtatg caggtagcaa gggaaatgtc atacttgaag tcggacagtg agtgtagtct 

     4561 tgagaaattc tgaagccgta tttttattat cagtgagtca gtcatcagga gatcctctac 

     4621 gccggacgca tcgtggccga cctgcagggg gggggggggc gctgaggtct gcctcgtgaa 

     4681 gaaggtgttg ctgactcata ccaggcctga atcgccccat catccagcca gaaagtgagg 

     4741 gagccacggt tgatgagagc tttgttgtag gtggaccagt tggtgatttt gaacttttgc 

     4801 tttgccacgg aacggtctgc gttgtcggga agatgcgtga tctgatcctt caactcagca 

     4861 aaagttcgat ttattcaaca aagccgccgt cccgtcaagt cagcgtaatg ctctgccagt 

     4921 gttacaacca attaaccaat tctgattaga aaaactcatc gagcatcaaa tgaaactgca 

     4981 atttattcat atcaggatta tcaataccat atttttgaaa aagccgtttc tgtaatgaag 

     5041 gagaaaactc accgaggcag ttccatagga tggcaagatc ctggtatcgg tctgcgattc 

     5101 cgactcgtcc aacatcaata caacctatta atttcccctc gtcaaaaata aggttatcaa 

     5161 gtgagaaatc accatgagtg acgactgaat ccggtgagaa tggcaaaagc ttatgcattt 

     5221 ctttccagac ttgttcaaca ggccagccat tacgctcgtc atcaaaatca ctcgcatcaa 

     5281 ccaaaccgtt attcattcgt gattgcgcct gagcgagacg aaatacgcga tcgctgttaa 

     5341 aaggacaatt acaaacagga atcgaatgca accggcgcag gaacactgcc agcgcatcaa 

     5401 caatattttc acctgaatca ggatattctt ctaatacctg gaatgctgtt ttcccgggga 

     5461 tcgcagtggt gagtaaccat gcatcatcag gagtacggat aaaatgcttg atggtcggaa 

     5521 gaggcataaa ttccgtcagc cagtttagtc tgaccatctc atctgtaaca tcattggcaa 

     5581 cgctaccttt gccatgtttc agaaacaact ctggcgcatc gggcttccca tacaatcgat 

     5641 agattgtcgc acctgattgc ccgacattat cgcgagccca tttataccca tataaatcag 

     5701 catccatgtt ggaatttaat cgcggcctcg agcaagacgt ttcccgttga atatggctca 

     5761 taacacccct tgtattactg tttatgtaag cagacagttt tattgttcat gatgatatat 

     5821 ttttatcttg tgcaatgtaa catcagagat tttgagacac aacgtggctt tccccccccc 

     5881 ccctgcaggt cggcatcacc ggcgccacag gtgcggttgc tggcgcctat atcgccgaca 

     5941 tcaccgatgg ggaagatcgg gctcgccact tcgggctcat gagcgcttgt ttcggcgtgg 

     6001 gtatggtggc aggccccgtg gccgggggac tgttgggcgc catctccttg catgcaccat 

     6061 tccttgcggc ggcggtgctc aacggcctca acctactact gggctgcttc ctaatgcagg 

     6121 agtcgcataa gggagagcgt cgagtatcta tgattggaag tatgggaatg gtgatacccg 

     6181 cattcttcag tgtcttgagg tctcctatca gattatgccc aactaaagca accggaggag 

     6241 gagatttcat ggtaaatttc tctgactttt ggtcatcagt agactcgaac tgtgagacta 

     6301 tctcggttat gacagcagaa atgtccttct tggagacagt aaatgaagtc ccaccaataa 

     6361 agaaatcctt gttatcagga acaaacttct tgtttcgaac tttttcggtg ccttgaacta 

     6421 taaaatgtag agtggatatg tcgggtagga atggagcggg caaatgctta ccttctggac 

     6481 cttcaagagg tatgtagggt ttgtagatac tgatgccaac ttcagtgaca acgttgctat 

     6541 ttcgttcaaa ccattccgaa tccagagaaa tcaaagttgt ttgtctacta ttgatccaag 

     6601 ccagtgcggt cttgaaactg acaatagtgt gctcgtgttt tgaggtcatc tttgtatgaa 

     6661 taaatctagt ctttgatcta aataatcttg acgagccaag gcgataaata cccaaatcta 

     6721 aaactctttt aaaacgttaa aaggacaagt atgtctgcct gtattaaacc ccaaatcagc 

     6781 tcgtagtctg atcctcatca acttgagggg cactatcttg ttttagagaa atttgcggag 

     6841 atgcgatatc gagaaaaagg tacgctgatt ttaaacgtga aatttatctc aagatctctg 

     6901 cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt 

     6961 cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg 

     7021 tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg gagtgtatac 

     7081 tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa 

     7141 ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc 

     7201 actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 

     7261 gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 

     7321 cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 

     7381 ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 

     7441 ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 

     7501 ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcaa 

     7561 tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 

     7621 cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 

     7681 aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 

     7741 gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 

     7801 agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 

     7861 ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 

     7921 cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 

     7981 tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 

     8041 aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 

     8101 tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 

     8161 atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata 

     8221 cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 

     8281 gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct 

     8341 gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt 

     8401 tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgctg caggcatcgt ggtgtcacgc 

     8461 tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 

     8521 tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 

     8581 aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 

     8641 atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 

     8701 tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa cacgggataa taccgcgcca 

     8761 catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca 

     8821 aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 

     8881 tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc 

     8941 gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa 

     9001 tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 

     9061 tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc 

     9121 taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt 

     9181 cgtcttcaag aattaattct catgtttgac agcttatcat cgataagctg actcatgttg 

     9241 gtattgtgaa atagacgcag atcgggaaca ctgaaaaata acagttatta ttcg 

//

AI质粒解析     

pPIC9K-His 载体完整介绍

pPIC9K-His质粒图谱

一、基础信息

• 载体类型：毕赤酵母 Pichia pastoris 整合型分泌表达载体（由原始 pPIC9K 改造）

• 全长：9286 / 9294 bp（不同测序版本微小差异，≈9.3 kb）

• 标签：C 端 6×His-tag（目的蛋白羧基端融合 His，镍亲和纯化）

⚠️区分：原始 pPIC9K无 His 标签；pPIC9K-His 在 MCS 下游添加 6×His 序列。

• 宿主菌（酵母）：GS115、KM71；大肠杆菌扩增宿主：DH5α、TOP10

• 应用：甲醇诱导、胞外分泌表达重组蛋白，方便后续 Ni-NTA 纯化

二、核心元件清单

1. 5’ AOX1 启动子

   甲醇严格诱导型强启动子；葡萄糖 / 甘油抑制，甲醇激活转录。

2. α-factor 酵母信号肽（α-MF）

   N 端信号序列，引导重组蛋白分泌至发酵上清；信号肽自带蛋白酶切割位点（Kex2/Ste13），成熟蛋白可释放。

✅关键：目的基因必须与信号肽读码框严格对齐，不能引入终止密码子！

1. 多克隆位点 MCS（信号肽下游）

   酶切顺序（信号肽→MCS→6×His→AOX1 终止子）

   SnaBⅠ - EcoRⅠ - AvrⅡ - NotⅠ

   克隆常规选择：EcoRⅠ + NotⅠ（最常用）

序列排布：目的基因插入 MCS，C 端自动接续 6×His 标签

❗重要：目的基因不要自带终止密码子，否则 His 标签无法融合！

1. 6×His Tag（C 端）

   序列：CATCACCATCACCATCAC

2. AOX1 TT 终止子：转录终止元件

3. 酵母筛选标记

• HIS4：组氨酸脱氢酶；转化后可在无组氨酸 MD 平板筛选阳性整合菌

• Kan^r (Neo)：G418 抗性；梯度 G418 筛选高拷贝整合菌株（多拷贝提高表达量）

1. 原核元件（大肠杆菌扩增）

• pBR322 ori：大肠杆菌复制起点

• Amp^R 氨苄抗性：大肠杆菌筛选

三、MCS 区域序列（关键）

plaintext

...GAGAAA GCT TTC GAA TTC CCT AGG GCG GCC GCA CAT CAC CAT CAC CAT CAC TAA
       ↑      ↑        ↑        ↑              ↑
     SnaBI   EcoRI    AvrII     NotI        6×His

阅读框架：

α-factor 信号肽 → [目的 CDS] → 6×His → Stop 密码子

四、质粒线性化（转化毕赤酵母必做）

整合载体必须线性化再电转，提高同源重组效率：

表格

常规优先 SacⅠ 线性化，获得 Mut⁺菌株；注意核查目的基因内部不含上述酶切位点。

五、测序引物（通用）

• 5’AOX1-F：5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'

• α-factor-F：5'-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3'

• 3’AOX1-R：5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'

六、构建与表达注意事项

1. 读码框问题

   引物设计时保证插入基因与 α-factor、下游 His 标签同框；

2. 终止密码子禁忌

   目的基因 3' 端不能加 TAA/TAG/TGA，否则翻译提前终止，丢失 His 标签；

3. 信号肽切割

   若蛋白 N 端不能多出额外氨基酸，优先选用 SnaBⅠ（无缝融合）；EcoRI 会额外增加氨基酸；

4. Mut⁺ vs Mutˢ

   Mut⁺生长快、诱导速度快；Mutˢ适合表达对甲醇敏感、毒性蛋白；

5. 纯化提示

   蛋白分泌至上清，可直接取发酵液上清进行镍柱纯化；若 His 标签被蛋白空间结构包裹，可考虑更换为 N-His 载体。

七、与 pPIC9K /pPIC9-His 对比

• pPIC9K：无 His 标签，G418 筛选高拷贝

• pPIC9K-His：pPIC9K 骨架 + C 端 6×His

• pPIC9-His：不含 Kan 抗性，无法 G418 筛选多拷贝