SPLICS Po-Mt Short P2A

(Plasmid #164116) 

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• Purpose

  Detect the short Peroxisomes-mitochondria contact

• Depositing Labs

  Marisa Brini, Tito Calì

• Publication

  Vallese et al Nat Commun. 2020 Nov 27;11(1):6069. doi: 10.1038/s41467-020-19892-6.( How to cite )

• Sequence Information

• Sequences (1)

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Ordering

Backbone

• Vector backbone

  pcDNA3.1

• Vector type

  Mammalian Expression

Growth in Bacteria

• Bacterial Resistance(s)

  Ampicillin, 100 μg/mL

• Growth Temperature

  37°C

• Growth Strain(s)

  DH5alpha

• Copy number

  High Copy

Gene/Insert

• Gene/Insert name

  Split GFP Po-Mt Short P2A

• Species

  H. sapiens (human)

Cloning Information

• Cloning methodRestriction Enzyme

• 5′ cloning siteUnknown (unknown if destroyed)

• 3′ cloning siteUnknown (unknown if destroyed)

Resource Information

• Supplemental Documents

• pcDNA3-SPLICS Po-Mt Short.gb

SPLICS Po-Mt Short P2A（Addgene #164116）完整信息

质粒环形图谱

一、基础标识

• 质粒全称：SPLICS Po-Mt Short P2A

• Addgene 货号：#164116

• 寄存实验室：Marisa Brini & Tito Calì（细胞器互作经典课题组）

• 发表文献：Vallese et al., Nat Commun, 2020（DOI:10.1038/s41467-020-19892-6）

二、核心用途

检测过氧化物酶体 (Peroxisome, Po) 与线粒体 (Mitochondria, Mt) 近距离膜接触位点

1. Short 版本定义：连接短甘丝 Linker，仅识别8–10 nm紧密膜接触（真实膜互作位点）；

2. 同系列 Long 对照：#164115 SPLICS Po-Mt Long P2A，识别 40–50 nm 远距离细胞器靠近；

3. 技术原理：split-GFP 双分子荧光互补（BiFC）

• GFP₁₋₁₀ 靶向线粒体外膜；

• GFPβ₁₁ 靶向过氧化物酶体膜；

• P2A 自剪切肽实现等摩尔共表达两个拆分荧光片段：

• 仅当两种细胞器膜距离≤10 nm 时，两段 GFP 组装重构绿色荧光，荧光点直接标记 Po-Mt 接触微域。

三、载体骨架与元件

1. 骨架载体：pcDNA3.1（哺乳动物强表达载体，CMV 启动子驱动）

2. 原核培养条件

• 细菌抗性：氨苄青霉素 Amp⁺（100 μg/mL）

• 宿主菌：DH5α

• 培养温度：37℃，高拷贝复制子

3. 真核筛选标记：Neo/G418 抗性，可构建稳定细胞株

4. 关键元件：CMV 启动子 → Po 靶向序列 - GFPβ₁₁-P2A-Mt 靶向 - GFP₁₋₁₀

四、命名拆解

表格

五、订购与适用范围

1. Addgene 售价：94 USD / 份（琼脂菌珠）

2. 使用权限：仅学术 / 非营利机构可用，工业企业不可订购

3. 适用体系：人源哺乳细胞（HeLa、MEF、原代细胞等）荧光显微镜活细胞 / 固定细胞成像

六、同系列对照质粒（Po-Mt 配对）

• #164116 SPLICS Po-Mt Short P2A（紧密接触，8–10 nm）

• #164115 SPLICS Po-Mt Long P2A（远距离靠近，40–50 nm）

七、实验应用场景

1. 氧化应激、脂代谢下过氧化物酶体 - 线粒体互作定量；

2. 过氧化物病、线粒体疾病模型中膜接触位点变化；

3. 药物筛选：调控 Po-Mt 膜接触的小分子 / 基因；

4. 3D 共聚焦 Z-stack 荧光点计数定量互作水平。

一、#164116 SPLICS Po-Mt Short P2A 质粒图谱

SPLICS Po-Mt Short P2A 全图谱

载体骨架：pcDNA3.1，CMV 启动子，Amp⁺原核抗性，Neo/G418 真核筛选

1. 通用测序引物（全 SPLICS 系列通用，直接测插入片段）

正向引物（CMV 上游，测 GFP11-Po 端）

pCMV-F1

5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’

结合位点：CMV 启动子区域，可覆盖 Po 靶向 - GFPβ11 全长

反向引物（BGH polyA 下游，测 GFP10-Mt 端）

BGH-R

5’-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3’

结合位点：BGH 终止子上游，覆盖 Mt 靶向 - GFP1₋₁₀、P2A 全长

中间验证引物（跨 P2A，确认双片段共表达框架）

P2A-F：5’-TTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGCGACGTGGAAG-3’

用于验证 P2A 自剪切肽序列是否完整无突变

2. 载体关键单一酶切位点（MCS / 插入区外围，适合亚克隆）

pcDNA3.1 骨架稀有单切点（插入片段内部无）：

• 5’端上游：NheI、HindIII、EcoRI

• 3’端下游：XhoI、XbaI、BamHI

  插入片段内部高频酶（不建议用于全长双酶切）：EcoRV、SacI、KpnI

插入片段拆分酶切方案（改造探针靶向信号用）

1. 切 Po-GFP11 模块：HindIII + PstI

2. 切 P2A-Mt-GFP10 模块：SacI + XhoI

3. 全长插入片段释放：HindIII + XhoI（完整 SPLICS 双顺反子）

二、SPLICS 全系列 Addgene 质粒完整清单（2020 Nat Commun 原版）

全部基于 pcDNA3.1-P2A 单质粒双拆分 GFP，Short=8–10 nm 紧密接触，Long=40–50 nm 远距离靠近

1. 线粒体 - 过氧化物酶体 Po-Mt（你当前质粒所属组）

表格

2. 过氧化物酶体 - 内质网 Po-ER

表格

3. 线粒体 - 内质网 Mt-ER（最常用线粒体互作探针）

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4. 内质网 - 细胞膜 PM-ER

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5. 三元互作 Mt-ER-PM（三细胞器同时检测）

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6. 溶酶体 - 线粒体 LY-Mt（溶酶体线粒体接触）

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三、补充实验关键信息

1. 元件线性顺序（#164116 完整插入）

   CMV → Pex19 过氧化物酶体靶向信号 → GFPβ₁₁（11 号片段）→ P2A 肽 → Tom20 线粒体外膜靶向信号 → GFP₁₋₁₀（1–10 片段）→ BGH polyA

2. 测序送样建议

• 初次鉴定：pCMV-F1 + BGH-R 双向测序，覆盖全部插入；

• 定点突变改造后：加测 P2A-F，确认剪切肽无移码突变。

1. 克隆避坑提示

• 不要用 EcoRV/SacI 双酶切，插入内部存在位点，会切断探针；

• 原核扩增：DH5α，LB+100 μg/mL Amp，37℃过夜；

• 真核转染：HeLa、MEF、原代肝细胞均可，转染 24–48 h 成像，绿色点状信号为 Po-Mt 接触位点。