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| 产品货号 | 产品类型 | 装载载体 | 基因信息 | 产品价格 | 出货周期 |
|---|---|---|---|---|---|
| Addgene #46911） | KRAB 介导基因沉默（CRISPRi 机制） | pHR-SFFV-dCas9-BFP-KRAB | pHR-SFFV-dCas9-BFP-KRAB | 480 | 现货 |
pHR-SFFV-dCas9-BFP-KRAB
pHR-SFFV-dCas9-BFP-KRAB（Addgene #46911）完整质粒解析
质粒环形图谱
一、基础核心信息
表格
| 项目 | 参数详情 |
|---|---|
| Addgene 编号 | #46911 |
| 载体骨架 | pHR 慢病毒穿梭载体（可包装慢病毒稳转细胞） |
| 总长度 | 14167 bp |
| 原核抗性 | Ampicillin 氨苄青霉素（100 μg/mL） |
| 推荐扩增菌株 | Stbl3（长片段重复序列稳定菌株） |
| 拷贝数 | 高拷贝 |
| 原始文献 | Gilbert et al., Cell, 2013（CRISPRi 经典奠基论文） |
| 核心用途 | CRISPRi 转录抑制（靶向可逆沉默基因，无 DNA 双链断裂） |
| 适用场景 | 体外细胞稳转、体内慢病毒递送、高通量基因敲低筛选 |
二、命名逐段元件拆解
pHR：二代慢病毒穿梭载体骨架，含 LTR、ψ 包装信号，可与 pCMV-dR8.91、VSV-G 共转 293 包装慢病毒，实现哺乳动物细胞稳定整合表达
SFFV：脾病灶形成病毒启动子，广谱强组成型启动子，免疫细胞、肿瘤细胞、原代细胞表达效率极高，不受细胞类型限制
dCas9：失活型 Cas9（D10A+H840A 双突变），完全丧失 DNA 切割酶活，仅作为 sgRNA 引导的 DNA 结合支架；两端携带2×NLS 核定位信号，确保蛋白入核
BFP（TagBFP）：蓝色荧光报告标签，流式 / 荧光显微镜可分选成功表达 dCas9 的阳性细胞群
KRAB：Krüppel 相关盒强转录抑制结构域，CRISPRi 核心效应元件
三、KRAB 介导基因沉默工作原理（CRISPRi 机制）
与单独 dCas9 仅靠空间位阻阻断 RNA 聚合酶不同，dCas9-KRAB 抑制效率提升 10~100 倍
sgRNA 引导 dCas9-KRAB 靶向基因启动子 / 转录起始位点附近；KRAB 招募 KAP1、SETDB1、HP1α 复合物
催化组蛋白 H3K9 三甲基化，形成异染色质，长效、可逆抑制靶基因转录，无基因组 DNA 损伤
可同时沉默编码基因、lncRNA，敲低效果温和可控，无敲除带来的细胞致死风险
四、完整融合蛋白结构（N→C 端）
dCas9 — 2×NLS — TagBFP — KRAB — HA 标签
HA 标签：用于免疫荧光 / WB 检测蛋白表达量
BFP 荧光：阳性细胞分选、共染标记区分 sgRNA 载体（常用绿色 / 红色荧光 sgRNA 骨架）
五、配套实验体系（慢病毒三质粒包装）
本载体：pHR-SFFV-dCas9-BFP-KRAB（表达抑制蛋白）
包装质粒：pCMV-dR8.91（Gag/Pol）
包膜质粒：pMD2.G（VSV-G，广谱细胞侵染）
搭配 sgRNA 骨架：pHR-U6-sgRNA-Puro /pLV-U6-sgRNA-mCherry（U6 启动子转录向导 RNA）
六、同系列对照质粒区分
表格
| Addgene 号 | 质粒名称 | 差异 | 用途 |
|---|---|---|---|
| #46911 | pHR-SFFV-dCas9-BFP-KRAB | 带 KRAB 抑制域 | CRISPRi 基因沉默（主力工具） |
| #46910 | pHR-SFFV-dCas9-BFP | 无 KRAB，仅 dCas9-BFP | 空白对照，仅占位无抑制 |
七、实验应用场景
基因功能筛选：全基因组 sgRNA 文库联合该载体，高通量筛选促癌 / 抑癌、耐药相关基因
可逆敲低模型：相比 siRNA 瞬时干扰，慢病毒稳转实现长期稳定抑制，可做细胞传代、动物体内实验
非编码 RNA 研究：lncRNA、增强子区域靶向沉默，不破坏基因组 DNA
共定位多色成像：BFP 蓝色荧光，可搭配 EGFP/mCherry 标记的 sgRNA 载体做多通道荧光区分阳性细胞
原代细胞研究：SFFV 启动子在原代神经元、免疫细胞、肝细胞均稳定高表达
八、关键使用注意事项
靶向位点优先选基因 TSS（转录起始位点）上游 - 50~+300 bp区间，沉默效率最高；靶向编码区抑制效果大幅下降
扩增必须使用 Stbl3 感受态，普通 DH5α 易发生 dCas9 长片段重组缺失
该载体是慢病毒系统，和你之前收集的 AAV 质粒骨架不通用；若需体内 AAV 递送 CRISPRi，需将 dCas9-KRAB 元件亚克隆至 pAAV-hSyn/TBG 等穿梭骨架
荧光分选：BFP 激发 399 nm、发射 456 nm，与 GFP、mCherry 荧光通道完全分开，无串色干扰
