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| 产品货号 | 产品类型 | 装载载体 | 基因信息 | 产品价格 | 出货周期 |
|---|---|---|---|---|---|
| pGP-CMV-ER-GCaMP6f | pGP-CMV-ER-GCaMP6f 普通瞬转质粒（pGP 骨架） | 680 | 现货 |
pGP-CMV-ER-GCaMP6f是适用于哺乳细胞进行蛋白表达,亚细胞定位的质粒。
定位原理：N‑末端 CYP450‑信号肽引导 GCaMP6f 进入内质网腔（ER‑lumen），不是胞质 GCaMP6f；
pGP‑CMV‑ER‑GCaMP6f 完整解析（和 #86918、#182501 区分清楚）
一、质粒基础参数（pGP 骨架）
载体骨架：pGP‑CMV‑GCaMP6f 原始骨架（基于 pEGFP‑N1 改造，Addgene #40755 的骨架）；人工在 GCaMP6f 的 N 端融合CYP450 内质网信号肽，将探针定位于 ER 腔，对应 #182548 的 ER 靶向元件。
核心元件排布
CMV 启动子‑ER 信号肽‑GCaMP6f‑SV40‑polyA
启动子：CMV 广谱强启动子，非细胞特异性；HEK‑293T、星形胶质细胞、神经元、肿瘤细胞均可高效表达；区别 #86918（CaMKII）、#182501（GFAP‑gfaABC1D）细胞特异性启动子。
原核抗性：Kanamycin（卡那霉素，50 μg/mL）；DH5α 扩增；高拷贝 pUC 复制子。
真核筛选标记：NeoR（G418 筛选），构建稳定细胞株可用。
插入片段：ER‑GCaMP6f；GCaMP6f 胞质版 KD≈105 nM；缺点：ER 腔内静息 Ca²⁺（400‑800 μM）下基础荧光偏高，动态范围下降，仅适合 ER 钙剧烈波动实验；若要稳态 ER 钙检测优先 #86918 的 GCaMP6‑150（KD=150 μM）。
质粒全长：约 6750 bp；激发 488 nm，发射 510 nm（绿色荧光）。
定位原理：N‑末端 CYP450‑信号肽引导 GCaMP6f 进入内质网腔（ER‑lumen），不是胞质 GCaMP6f；用来观察内质网钙变化，同时可验证 ER‑GCaMP6f 在体外哺乳细胞内的亚细胞分布情况Addgene。
二、质粒用途（正如你所说）
体外细胞瞬时转染（HEK293‑T、原代星形胶质细胞、原代神经元、肿瘤细胞），用于细胞水平 ER‑Ca²⁺荧光成像、SERCA、IP3R 相关体外机制验证；
蛋白表达与亚细胞定位观察：荧光直接判断探针是否成功定位于内质网；
克隆中间载体：可以把 ER‑GCaMP6f 片段切下来，亚克隆至 AAV 骨架（构建 AAV‑CMV‑ER‑GCaMP6f）或慢病毒骨架；
构建稳定细胞系：G418 筛选获得稳定表达 ER‑GCaMP6f 细胞株用于高通量药物筛选。
局限：CMV 启动子只适合体外细胞，体内小鼠脑内注射 CMV 会被表观沉默；体内胶质细胞 ER‑Ca²⁺成像必须选用 #182501（GFAP 启动子‑AAV5）；神经元体内实验用 #86918 改造 AAV 版本。
三、三个质粒核心对比（#86918、#182501、pGP‑CMV‑ER‑GCaMP6f）
表格
| 质粒 | 启动子 | GCaMP 突变体 | 载体形式 | 适用场景 |
|---|---|---|---|---|
| #86918 ER‑GCaMP6‑150 | CaMKII‑1.3kb（兴奋性神经元特异） | GCaMP6‑150（KD=150 μM 适配 ER 高钙） | 慢病毒 FCK‑GW | 原代神经元、体内神经元 ER‑Ca²⁺成像 |
| #182501 GFAP‑ER‑GCaMP6f‑AAV5 | gfaABC1D‑GFAP（星形胶质细胞特异） | GCaMP6f（KD 极低） | AAV2 骨架，包装 AAV5 | 体外胶质细胞、活体小鼠星形胶质细胞实验 |
| pGP‑CMV‑ER‑GCaMP6f | CMV 广谱启动子 | GCaMP6f（KD 极低） | 普通瞬转质粒（pGP 骨架） | 仅限体外哺乳细胞瞬时转染、亚细胞定位验证，不适合体内动物实验 |
四、克隆改造方案
上下游酶切位点：BglⅡ‑NotⅠ 可以切下 ER‑GCaMP6f 全长片段；
替换启动子：BglⅡ 位点切除 CMV，接入 hSyn‑1、GFAP、CAG；
亚克隆 AAV：将 ER‑GCaMP6f 插入 pAAV‑WPRE‑SV40‑pA 骨架，构建 AAV‑CMV‑ER‑GCaMP6f 用于体外细胞 AAV 感染。
五、转染条件参考
HEK‑293T：质粒：PEI=1:3；48‑72 h 成像；
原代星形胶质细胞：Lipofectamine3000 转染；转染后 3‑5 天进行 ER 钙记录。
如果你需要，我可以输出：
ER‑GCaMP6f 完整 FASTA 序列；
BglⅡ‑NotⅠ 酶切位点图谱；
把该片段构建到 AAV 载体的引物设计方案。
