内质网（ER）靶向的 GCaMP 钙荧光探针 #86918 ER‑GCaMP6‑150

Addgene #86918 ER‑GCaMP6‑150 质粒完整信息Addgene

#86918质粒图谱

1. 基础概况

• 质粒全称：ER‑GCaMP6‑150（Addgene ID：#86918）

• ** depositing 实验室 **：Timothy Ryan 实验室

• 原始文献：de Juan‑Sanz et al., Neuron,2017；文章证明轴突内质网 Ca²⁺含量调控突触释放概率。

• 核心用途：内质网（ER）靶向的 GCaMP 钙荧光探针，特异性监测神经元内质网腔内 Ca²⁺浓度变化；GCaMP6‑150 是高亲和力突变体（Kd≈150 μM），适配 ER 内高钙环境，普通胞质 GCaMP 不适合 ER 钙检测Addgene。

2. 载体骨架与元件参数

1. 载体类型：慢病毒载体（Lentiviral）、哺乳动物细胞表达质粒；骨架为 FCK (1.3) GW

• 骨架长度：9246 bp；全长质粒：10698 bp；插入片段 ER‑GCaMP6‑150：1452 bpAddgene

2. 启动子：CaMKII 启动子，只在兴奋性神经元特异性表达，胶质细胞不表达；适合原代神经元实验。

3. 抗性元件

• 细菌筛选：氨苄青霉素（Ampicillin 100 μg/mL）；推荐菌株 NEB Stable，37 ℃培养。

• Zeocin 标记位于 LTR 片段外侧，包装慢病毒时不会被包装进病毒颗粒，仅用于质粒扩增时细菌筛选Addgene。

4. GCaMP 突变背景：基于 GCaMP3 引入多点突变（K78H、T302L、R303P、A317E、D324G、D360G、D380Y、T381R、S383T、R392G）得到 GCaMP6‑150；搭配 ER 定位信号肽，将探针定位于 ER 腔内侧Addgene。

3. 适用与不适用场景

适用场景

1. 原代神经元、轴突末梢内质网钙动态成像；

2. 慢病毒包装后感染神经元，长时程 ER‑Ca²⁺荧光记录；

3. 研究 IP3 受体、SERCA 泵、ER 钙稳态、突触前释放概率。

局限性

1. CaMKII 启动子限制：星形胶质细胞、非兴奋性神经元中几乎不表达；若要星形胶质细胞 ER 钙检测需要换 GFAP 启动子版本（如 #182501）；

2. 仅强度成像（非比率型），只能观测相对钙变化；如需定量 ER 钙可选用同实验室后续开发的 Halo‑GCaMP6‑150 比率型探针（#216316）Addgene；

3. 仅学术非营利机构可向 Addgene 索取质粒，商业用途需要 MTA 授权。

4. 克隆与载体改造要点

• 插入位点：Age‑I 单酶切位点可用于替换启动子（如 hSyn‑1、CMV 替换 CaMKII）；

• 可亚克隆至 pAAV 骨架制备 AAV‑ER‑GCaMP6‑150，用于体内脑区 ER 钙成像；

• 测序引物：Addgene 页面提供测序引物可验证插入序列。

5. 获取方式

Addgene 官方售价：94 USD（琼脂菌珠形式）；仅限学术科研人员申请质粒Addgene。

如果你需要，我可以把：质粒全序列（FASTA 格式）、酶切位点清单、AAV 亚克隆方案、慢病毒包装体系给你整理出来。