pIZT/V5-His

pIZT/V5-His 昆虫细胞组成型表达载体

一、基础信息

pIZT/V5-His 质粒图谱

1. 来源：Thermo Fisher (原 Invitrogen) InsectSelect™ Glow 系统配套载体，货号 V801001

2. 全长：3336 bp

3. 宿主

• 原核扩增：DH5α/DH10B，LB 加 Zeocin 筛选

• 真核表达：昆虫细胞（Sf9、Sf21、High Five）

4. 表达模式：无病毒、组成型持续表达，无需杆状病毒包装，瞬时转染 / 稳定细胞株均可使用

二、核心元件分区

1）目的蛋白表达盒（OpIE2 驱动）

• OpIE2 立即早期启动子：源自云杉卷叶蛾多角体病毒，昆虫细胞强持续启动子，不依赖病毒复制

• MCS 多克隆位点（酶切位点顺序）：Acc65I / KpnI / Ecl136II / SacI / SpeI / EcoRI / EcoRV / NotI / XbaI / DraII / SacII / AgeI

• C 端双标签（读码框融合）：V5 抗原表位 + 6×His 标签

• V5：WB 免疫检测（抗 V5 单抗）

• 6×His：Ni 柱亲和纯化重组蛋白

• OpIE2 polyA：昆虫细胞转录终止信号

2）稳定筛选标记盒（OpIE1+EM7 双启动子）

• OpIE1（昆虫细胞）+ EM7（原核通用组成型启动子）双驱动 GFP-Zeo 融合蛋白

• Zeocin（ble 博来霉素抗性）：原核扩增 + 昆虫稳定株双筛选

• GFP 绿色荧光：荧光显微镜直观鉴定转染阳性细胞，无需额外染色

• SV40 polyA：标记基因终止信号

3）原核复制元件

• pUC ori：高拷贝复制子，质粒扩增量大

三、关键优势

1. 免杆状病毒：直接转染昆虫细胞，操作简单，周期短；适合小规模蛋白、细胞功能实验

2. 双筛选 + 荧光可视化：Zeocin 药物筛选 + GFP 荧光双验证，快速获得纯稳定细胞系

3. C 端双标签：检测、纯化一步到位，标签位于蛋白末端，极少影响目的蛋白折叠

4. 瞬时 / 稳定双用途：转染后 3 天即可瞬时收样；加 Zeocin 加压筛选得到持续表达稳株

四、常规实验流程

1. 目的基因插入 MCS，保证与下游 V5/6×His 同读码框（无移码突变）

2. 重组质粒转化大肠杆菌，Zeocin 抗性 LB 扩增、提质粒

3. 脂质体转染 Sf9/Sf21 细胞

• 瞬时表达：转染 48–72 h 收细胞裂解液检测

• 稳定细胞株：转染 72 h 后加 Zeocin 加压筛选，荧光分选获得单克隆

4. 蛋白检测：Anti-V5 WB；蛋白纯化：Ni-NTA 琼脂糖亲和层析

五、配套测序引物

OpIE2 Forward（上游测序）：CGCAACGATCTGGTAAACAC

六、同系列区分

• pIZ/V5-His：无 GFP，仅 Zeocin 筛选，更小（~2900 bp）

• pIZT/V5-His：带 GFP-Zeo 融合，荧光可视化筛选，即本文载体

七、适用场景

• 昆虫细胞内源蛋白功能验证

• 真核折叠重组蛋白小量表达纯化

• 稳定昆虫细胞株构建、亚细胞定位（GFP 辅助观察细胞状态）

• 无需高产量、排斥杆状病毒复杂操作的实验