pBI121-Chlo-CFP

pBI121-Chlo-CFP 质粒完整介绍

一、质粒基础分类

1. 载体骨架：经典植物双元农杆菌载体 pBI121（原始载体含 GUS，本载体替换为叶绿体荧光标记模块）

2. 载体类型：农杆菌介导植物稳定 / 瞬时转化双元表达载体、叶绿体亚细胞定位标记质粒

3. 宿主范围

• 原核扩增：大肠杆菌 DH5α、TOP10（卡那筛选）

• 植物宿主：拟南芥、烟草、水稻、番茄等双子叶 / 单子叶植物

4. 核心用途：植物细胞叶绿体荧光示踪、共定位实验、叶绿体蛋白互作标记

二、核心结构元件（T-DNA 表达盒）

1. 表达盒顺序

CaMV 35S 强组成型启动子 → Chlo（叶绿体转运肽 cTP）→ CFP 青色荧光蛋白 → NOS 终止子

• CaMV 35S：植物广谱强启动子，全组织持续高表达

• Chlo（cTP 叶绿体转运肽）：多采用 Rubisco 小亚基转运肽（拟南芥 / 烟草来源），N 端信号肽引导融合蛋白进入叶绿体基质，荧光信号特异性定位于叶绿体

• CFP（青色荧光蛋白）

• 激发波长：434 nm

• 发射波长：476 nm

• 优势：与 GFP/mCherry 光谱区分度高，适合多色共定位

• NOS 终止子：胭脂氨酸合成酶终止序列，稳定终止转录

2. 筛选标记元件

1. 原核筛选（大肠杆菌）：NptII 卡那霉素抗性（Kanᵣ），LB 培养基加 Kan 扩增质粒

2. 植物细胞筛选：同NptII，转化植株用卡那霉素 / 遗传霉素 G418 筛选阳性愈伤、幼苗

3. 复制与边界元件

• T-DNA 左右边界 LB/RB：农杆菌侵染时，边界内 35S-Chlo-CFP 整合进植物基因组，用于稳定株构建

• oriV 复制子：大肠杆菌内低拷贝复制，质粒稳定性高

• 原始 pBI121 多克隆位点保留，可额外插入目的基因与 CFP 共表达

三、关键参数汇总表

表格

四、载体功能与优势

1. 专一叶绿体标记

   Chlo 转运肽可将 CFP 高效转运至叶绿体，荧光信号仅富集叶绿体，无胞质 / 线粒体背景干扰，是通用叶绿体 marker。

2. 兼容瞬时 + 稳定转化

• 瞬时：烟草叶片农杆菌侵染、原生质体转染，24–72 h 即可激光共聚焦成像；

• 稳定：农杆菌转化拟南芥 / 水稻，T-DNA 整合基因组，获得稳定荧光标记株系。

3. 多色成像适配

   CFP 光谱独立于 GFP（488/507）、mCherry（587/610），可与线粒体、内质网、微管荧光质粒共转做多细胞器共定位（可和你文档里超视计哺乳细胞荧光质粒做跨体系对照）。

4. 通用性强

   35S 启动子不受组织 / 发育时期限制，适用于叶片、根、愈伤、原生质体等各类植物材料。

五、常规实验操作流程简述

1. 质粒扩增：转化 DH5α，Kan⁺ LB 摇菌，质粒提取；

2. 农杆菌转化：重组质粒转入 GV3101/EHA105 农杆菌；

3. 植物侵染：烟草瞬时注射 / 拟南芥浸花转化；

4. 筛选（稳定株）：培养基添加 G418 筛选阳性植株；

5. 成像：激光共聚焦显微镜，434 nm 激发观察叶绿体青色荧光。

六、与你前文哺乳细胞荧光质粒的核心区别

1. 宿主体系不同

• pBI121-Chlo-CFP：植物双元载体，农杆菌转化，用于植物叶绿体标记；

• GFP-sec61b/TOM20-mCherry 等：哺乳细胞瞬时转染质粒（pEGFP-N1/C1 骨架），脂质体转染，人 / 动物细胞细胞器标记。

2. 定位信号类型

   植物用叶绿体转运肽 cTP；哺乳细胞用 Sec61、TOM20、LAMP1 等膜蛋白全长序列。

3. 转化系统

   植物依赖农杆菌 Ti 质粒 T-DNA 整合；动物细胞仅游离质粒瞬时表达，无基因组整合。

七、适用研究场景

1. 未知植物蛋白亚细胞定位共定位对照（共转待测基因 - mCherry + pBI121-Chlo-CFP）；

2. 叶绿体形态、数量、分裂动态活体荧光观察；

3. 叶绿体与线粒体 / 过氧化物酶体互作荧光双标实验；

4. 叶绿体胁迫响应、光合相关基因功能可视化研究。