pGREAT5
(Plasmid #170893)

强启动子驱动的荧光素酶 + 红色荧光蛋白双报告模块，适配农杆菌介导的植物瞬时 / 稳定转化

pGREAT5（#170893）质粒简介、特点与应用

一、基础简介

pGREAT5（Plasmid #170893） 是植物合成生物学专用的 GoldenBraid 标准双转录单元（Dual-TU）报告载体，2021 年由 Markita Landry 团队 depositing，发表于ACS Synthetic Biology，全长约 11.2 kb，核心为强启动子驱动的荧光素酶 + 红色荧光蛋白双报告模块，适配农杆菌介导的植物瞬时 / 稳定转化。

核心元件（T-DNA 区，双独立表达盒）

第一转录单元（定量报告）：pCmYLCV911（锦葵花叶病毒强启动子）→E-Luc（增强型萤火虫荧光素酶）→NOSt（NOS 终止子）

第二转录单元（可视化报告）：pNOS（胭脂碱合成酶启动子）→Red-F（红色荧光蛋白）→NOSt

骨架与筛选：

原核：ColE1（高拷贝）+Kanᵣ（卡那霉素抗性）；

植物：pCAMBIA 二元骨架，适配 GV3101/EHA105 等农杆菌，无额外植物筛选标记（依赖报告基因筛选）。

GoldenBraid 适配：含BsaI/BsmBI 稀有酶切位点，标准化模块组装，自带沉默突变去除冗余 BbsI 位点，避免干扰克隆。

二、五大核心特点

1. 双报告 “定量 + 可视化” 黄金组合

E-Luc（增强型荧光素酶）：超高灵敏度（10⁻¹⁸ mol）、宽线性范围，可精准定量基因表达水平，适合启动子活性、转录调控的数值化分析；

Red-F（红色荧光蛋白）：活体可视、低背景、组织穿透性强，可直接荧光显微镜观察，无需底物，用于快速定性筛选、组织定位、转化效率评估。

优势：同一植株同步获得 “定量数据 + 图像证据”，解决单报告只能定性或定量的局限。

2. pCmYLCV911 超强组成型启动子

活性远超 CaMV35S（3-5 倍），且在单子叶 / 双子叶植物中均高效表达，不受组织 / 发育阶段限制；

低甲基化、沉默风险低，稳定转化株表达更均一，适合需要高表达的报告系统。

3. GoldenBraid 标准化模块化设计

兼容Golden Gate（Type IIS 酶）克隆，可快速替换启动子、报告基因、终止子等元件；

双转录单元可独立改造：保留一个报告，替换另一个为目的基因，实现 “过表达 + 报告示踪” 一步到位。

4. 农杆菌二元骨架，植物适配性广

继承 pCAMBIA 成熟骨架，烟草、拟南芥、水稻、玉米、大豆等主流植物均适用；

瞬时转化（烟草叶片）2-3 天出结果，稳定转化可获得遗传群体，瞬时 + 稳定双模式通用。

5. 无植物筛选标记，低背景、易筛选

去除传统潮霉素 / 卡那霉素植物抗性，避免抗生素对植物生长的干扰；

直接通过Red-F 荧光初筛 + E-Luc 酶活复筛，阳性株筛选更高效、无假阳性。

三、主流应用场景

1. 启动子活性定量与时空表达分析（最常用）

替换 pCmYLCV911 为待测内源启动子，驱动 E-Luc；Red-F 为内参（pNOS 组成型表达）；

E-Luc：定量检测启动子活性强弱、诱导倍数（如胁迫 / 激素处理）；

Red-F：荧光观察启动子在根 / 茎 / 叶 / 花的组织特异性表达；

实例：水稻 OsRGA、拟南芥 ABI5 等胁迫相关启动子的活性验证。

2. 基因过表达 + 活体示踪（功能基因研究）

切除 E-Luc，插入目的基因（如抗病 / 抗逆基因），保留 pNOS::Red-F；

Red-F 荧光标记阳性转化株，无需 PCR / 抗生素筛选，直接观察基因表达部位；

实例：大豆 GmWRKY46 过表达，Red-F 标记发根，研究其对根瘤发育的影响。

3. 转录因子 /miRNA 调控机制验证

双荧光素酶报告实验：将靶基因启动子（含转录因子结合位点）驱动 E-Luc，共表达转录因子；Red-F 为内参，消除转化效率误差；

miRNA 靶向验证：E-Luc 3’UTR 插入 miRNA 结合序列，共表达 miRNA，通过 E-Luc 活性变化判断靶向抑制效果。

4. 植物合成生物学：多基因回路构建

利用 GoldenBraid 模块化特性，串联多个 pGREAT5 类转录单元，构建复杂基因回路（如代谢通路、信号通路）；

E-Luc+Red-F 作为回路输出报告，实时监测基因表达动态，优化回路设计。

5. 农杆菌转化体系优化

烟草叶片瞬时转化，通过Red-F 荧光计数统计侵染效率，E-Luc 酶活评估表达水平；

快速优化菌液浓度、侵染时间、共培养温度等参数，新物种转化体系建立的首选载体。

四、与 pGFPGUSPlus 对比（核心差异）

表格

特征 pGREAT5（#170893） pGFPGUSPlus（#64401）

报告组合 E-Luc（定量）+Red-F（荧光） GFP（荧光）+GUSPlus（染色）

核心优势 超高灵敏度定量、活体可视化 细胞定位精细、染色信噪比高

启动子 pCmYLCV911（强于 35S） CaMV35S（标准）

筛选方式 荧光 + 酶活（无抗生素） 潮霉素筛选 + 荧光 / 染色

适用场景 定量分析、合成生物学、活体动态 细胞定位、启动子组织表达、稳定株筛选

 Print

• Purpose

  GoldenBraid Double Transcriptional Unit - pCmYLCV911_E-Luc_NOSt+pNOS_Red-F_NOSt

• Depositing Lab

  Markita Landry

• Publication

  Gonzalez-Grandio et al ACS Synth Biol. 2021 Sep 14. doi: 10.1021/acssynbio.1c00248.( How to cite )

• Sequence Information

• Sequences (1)

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Ordering

Backbone

• Vector backbone

  pDGB1_omega1

• Backbone manufacturer

  Diego Orzaez Lab

• Backbone size w/o insert (bp)2925

• Vector type

  Plant Expression, Luciferase, Synthetic Biology

Growth in Bacteria

• Bacterial Resistance(s)

  Spectinomycin, 50 μg/mL

• Growth Temperature

  37°C

• Growth Strain(s)

  DH5alpha

• Copy number

  High Copy

Gene/Insert

• Gene/Insert name

  E-Luc

• Alt name

  Enhanced beetle luciferase

• Species

  Pyrearinus termitilluminans (E-Luc) and Luciola curciata (Red-F)

• Insert Size (bp)

  5046

• Mutation

  c.375C>T silent mutation to remove BbsI site (E-Luc), p.S286Y Red mutant (RedF)

• PromoterpCmYLCV911

Cloning Information

• Cloning methodRestriction Enzyme

• 5′ cloning siteEsp3I (destroyed during cloning)

• 3′ cloning siteEsp3I (destroyed during cloning)

• 5′ sequencing primerGGGAAACGCCTGGTATCTTT

• 3′ sequencing primerCCGATCCCCGGAATTAGATC

• (Common Sequencing Primers)

Resource Information

• Supplemental Documents

• pGREAT5.gb

Terms and Licenses

• Academic/Nonprofit Terms

• UBMTA

• Industry Terms

• Not Available to Industry

Trademarks:

• Zeocin® is an InvivoGen trademark.

Depositor Comments

Encodes both E-Luc and Red-F transcriptional units. Insert can be excised by BsaI digestion. Requires pSOUP for replication in agrobacterium . Please visit https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.05.26.443018v2 to read the preprint on bioRxiv

How to cite this plasmid( Back to top)

These plasmids were created by your colleagues. Please acknowledge the Principal Investigator, cite the article in which the plasmids were described, and include Addgene in the Materials and Methods of your future publications.

• For your Materials & Methods section:

  pGREAT5 was a gift from Markita Landry (Addgene plasmid # 170893 ; http://n2t.net/addgene:170893 ; RRID:Addgene_170893)

• For your References section:

  A Ratiometric Dual Color Luciferase Reporter for Fast Characterization of Transcriptional Regulatory Elements in Plants. Gonzalez-Grandio E, Demirer GS, Ma W, Brady S, Landry MP. ACS Synth Biol. 2021 Sep 14. doi: 10.1021/acssynbio.1c00248. 10.1021/acssynbio.1c00248 PubMed 34520169

序列：taacggatccggtctcaggagtggcagacatactgtcccacaaatgaagatggaatctgtaaaagaaaacgcgtgaaataatgcgtctgacaaaggttaggtcggctgcctttaatcaataccaaagtggtccctaccacgatggaaaaactgtgcagtcggtttggctttttctgacgaacaaataagattcgtggccgacaggtgggggtccaccatgtgaaggcatcttcagactccaataatggagcaatgacgtaagggcttacgaaataagtaagggtagtttgggaaatgtccactcacccgtcagtctataaatacttagcccctccctcattgttaagggagcaaaatctcagagagatagtcctagagagagaaagagagcaagtagcctagaagtagtcaaggcggcgaagtattcaggcaggtggccaggaagaagaaaagccaagacgacgaaaacaggtaagagctaagcttaatggagagagagaagaacgtggtgtacggccccgagcccaagcaccctctgggcaacttcaccgccggcgagatgctgtacaacgctctgcacaagcactcccacatcccccaggccatcctggacgtgatgggcaacgagtccctttcctaccaggagttcttcgacactactgtgaagctgggccagagcctccagaactgtggctacaagatgaacgatgtcgtgtcgatctgtgcagagaacaacaagagattcttcatccccatcatctccgcctggtacatcggcatggtggtggcccctgtgaacgaggactatatcccagacgagctgtgtaaagtgaccggcatctccaagccgatcctggtctttaccactaggaagatcctgcctaaggttttggaggttaaagacagaaccaactacataaagaggatcatcatactggactctgaagagaacctgctgggctgcgagagcctgcacaacttcatgtccaggtactccgacaacaacctccaaacattcaagcctctgcactacgaccctgtggaccaggtagccgccatcctgtgctcctccggcacaaccggcctgcctaaaggcgtgatgcagacccacaggaacatctgtgtgagactcacacacgcatctgaccccagagtgggtacacaactcatccccggcgtatccgtgctggcctacctgccattcttccacgccttcggcttcagtatcaacctgggctatttcatggtgggcctgagagtggtgatgctccgaaggtttaaccaggaggtgttcctgaaggccatccaggactacgaggtgaggagcgtgatcaacgttccctccacaatcctgttcctgtccaagagccctctggtggacaagtacgacctatccaccctggcggagctgtgctgtggagccgctcctctggcgaaggaggtggccgagatcgccgtgaagaggctgaacctgccagggatacggtgtggctacggtctaacagagtctacctccgccaacatccatactctgcacaacgagttcaagtccggctccctgggcaaggtgacaccttacatggccgccaagatcatcgacaggaacaccggcgaggccctgggtccaaaccaggtgggcgagctgtgcatctggggacctatggtaacaaaaggctatgtgaacaacccacaggctactaaggaggccatcgacgacgacggctggctgcactctggcgacttcggctactacgacgaggacgagtatttctacatcgtggaccggtacaaggagctgatcaaatacaagggctatcaggtcgcccctgtggagctggaggagatcctccttcagcacccaggcatcagggacgtggccgtcgtgggtatccctgacatcgaggccggcgagctgccagccggcttcgtggtgaagcagcccggcgcccaactcaccgctaaggaggtgtacgacttcctggcccagagggtgtctcactccaagtacctgaggggcggcgtaaggttcgtggactctatccccaggaacgtgacaggcaagattagtcgaaaagagctgagggaggccctgatggagaaggcttctaagctgtaagcttggaatggatcttcgatcccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgacgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattgccaagctaattcttgaagatgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatgggaccgactcgcgctgtcaggagatacatgagaattaagggagtcacggtatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactgagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcagaaaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgacgttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaactcgatcgaggcaatggagaacatggagaacgacgagaacattgtggtgggacccaagccgttctacccgatcgaggagggttccgctggcacccagctgcgcaagtacatggagcgctacgctaagctgggtgctatcgccttcaccaacgccgtgaccggtgtggattactcctacgccgagtacctggagaagtcctgctgcctcggaaaggccctgcagaactacggtctggtcgtggatggccgcattgccctctgctcggagaactgcgaggagttcttcattcccgtgatcgctggtctgttcatcggagtcggcgttgccccaaccaacgagatctacaccctgcgcgagctggtccacagcctgggtatcagcaagccgaccatcgttttctcgagcaagaagggcctcgacaaggttatcaccgtgcaaaaaaccgtcaccaccatcaagaccatcgttatcctggattccaaggttgactaccgcggttaccagtgcctcgacaccttcatcaagcgtaacaccccacccggcttccaagcctcctccttcaaaaccgtggaggttgatcgcaaggagcaggtggccctgatcatgaactcctccggctccaccggtctgccaaagggcgtgcagctgacccacgagaacaccgtcacccgcttctcgcatgcccgtgatcccatctacggcaaccaggtgtccccaggcaccgccgtcctgaccgtcgtgcccctccaccacggcttcggcatgttcaccactctcggctacttgatctgcggcttccgtgtggtgatgctgactaagttcgacgaggagactttcctcaagaccctgcaagactacaagtgcacttacgtgatcctggtgccgaccctgttcgccatcctgaacaagagcgagctgttgaacaaatacgacctgtcgaacctggtggagatcgcttccggcggcgccccactgtcgaaggaagttggcgaggccgttgctcgccgcttcaacctgcccggcgtccgtcagggttacggcctgaccgagactacctcggctatcatcatcacccccgagggcgacgataagcccggcgcttccggcaaggttgttccactcttcaaagccaaggtgatcgacctggacaccaagaagtccctgggtcccaaccgtcgcggagaagtgtgcgtcaagggccccatgctgatgaagggctacgtcaacaacccagaggccaccaaggagttgatcgacgaggagggctggctgcacactggtgacatcggttactacgacgaagagaagcacttcttcatcgttgaccgcctgaagtccttgatcaagtacaagggctaccaggttccccccgccgagctcgagagcgtcctgctgcagcacccctccattttcgatgccggagtggccggtgtccccgatcccgtggctggcgagctgccaggtgccgtcgtcgtgctggagtccggcaagaacatgaccgagaaggaagtgatggattacgtggcctcgcaagtgtccaacgccaagcgcctgcgcggcggcgtgcgcttcgtggatgaggtgcccaagggcctcaccggaaagatcgacggtcgcgctatccgcgagatcctcaagaagcccgtggccaagatgtgagcttggaatggatcttcgatcccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgacgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattgccaagctaattcttgaagatgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattc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