pGFPGUSPlus
(Plasmid #64401)

GFP 活体无损观察 + GUSPlus 原位染色精确定位

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• Purpose

  Binary plant vector expressing GFP and GUS, both driven by a 35S promoter

• Depositing Lab

  Claudia Vickers

• Publication

  Vickers et al Biotechnol Lett. 2007 Nov;29(11):1793-6. Epub 2007 Aug 9.( How to cite )

• Sequence Information

• Sequences (3)

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Ordering

Backbone

• Vector backbone

  pCAMBIA1305.1

• Backbone manufacturer

  CAMBIA

• Vector type

  Plant Expression ; binary vector for plant transformation

• Selectable markers

  Hygromycin

Growth in Bacteria

• Bacterial Resistance(s)

  Kanamycin, 50 μg/mL

• Growth Temperature

  37°C

• Growth Strain(s)

  DH5alpha

• Copy number

  High Copy

Gene/Insert 1

• Gene/Insert name

  GFP

• Mutation

  S65T

• GenBank ID

  ABQ22954.1

• Promoter35S

Cloning Information for Gene/Insert 1

• Cloning methodRestriction Enzyme

• 5′ cloning siteHindIII (not destroyed)

• 3′ cloning siteEcoRI (not destroyed)

• 5′ sequencing primerM13-F20

• 3′ sequencing primerM13-R

• (Common Sequencing Primers)

Gene/Insert 2

• Gene/Insert name

  GUSPlus

• GenBank ID

  ABQ22951.1

• Promoter35S

• Tag / Fusion Protein

• His (C terminal on insert)

Cloning Information for Gene/Insert 2

• Cloning methodUnknown

• 5′ sequencing primerNA

• (Common Sequencing Primers)

Resource Information

• Supplemental Documents

• pGFPGUSplus genbank file

• A portion of this plasmid was derived from a plasmid made by

  CAMBIA

• Articles Citing this Plasmid

• 16 References

Terms and Licenses

• Academic/Nonprofit Terms

• UBMTA

• Industry Terms

• Not Available to Industry

Trademarks:

• Zeocin® is an InvivoGen trademark.

Depositor Comments

GenBank record number for the full plasmid seqeunce: EF546437.1

The 35S:GFP:NOS expression cassette from p35SsGFP was cloned into pCAMBIA1305.1 upstream and in the opposite orientation to the 35S:GUSPlus:NOS cassette. Expression of both reporter genes benefits from the enhancer elements found in the two 35S promoters.

pGFPGUSPlus (Plasmid #64401)简介 特点说明和应用

pGFPGUSPlus（#64401）质粒简介、特点与应用

pGFPGUSPlus质粒图谱

一、质粒基础简介

pGFPGUSPlus #64401是基于 pCAMBIA1305.1 改造的植物农杆菌二元载体，2007 年由 Vickers 团队构建发表于Biotechnol Lett，Addgene 全平台植物报告质粒常年 TOP1 载体，全长约 13.7 kb，是植物转基因领域双报告基因标杆载体。

核心元件（T-DNA 区）

1. 双独立报告盒（均为增强型 CaMV35S+NOS 终止子）

• 35S::GFP：绿色荧光蛋白，活体荧光观察；

• 35S::GUSPlus：优化版 GUS（改良 β- 葡萄糖苷酸酶，带 6×His 标签，酶活远高于普通 GUS），化学染色显色；

2. 植物筛选标记：潮霉素抗性基因 HygR，用于稳定转基因植株抗生素筛选；

3. 载体骨架：pVS1（农杆菌复制子）+ColE1（大肠杆菌高拷贝复制子），原核筛选：卡那霉素 Kanᵣ；

4. T-DNA 左右边界 LB/RB：农杆菌介导外源基因整合植物基因组。

二、五大核心特点

1. 双报告互补检测（最大优势）

GFP 活体无损观察 + GUSPlus 原位染色精确定位

• GFP：活体、整株 / 组织直接荧光成像，无需固定、不破坏材料，快速初筛阳性；

• GUSPlus：酶活更强、显色灵敏度远超普通 GUS，切片后精细细胞定位、微量表达检出，解决单报告短板。

2. GUSPlus 改良优势

天然 GUS 易受植物内源酶干扰，GUSPlus 源自葡萄球菌，植物无同源内源酶，背景极低、染色信噪比高，微量基因表达也可显色，还自带 His 标签可蛋白 Western 验证。

3. 经典 CAMBIA 二元骨架通用性强

继承 pCAMBIA 成熟骨架，双子叶（拟南芥、烟草、大豆）+ 单子叶（水稻、玉米、小麦）全能适配，农杆菌 GV3101/EHA105/LBA4404 均可稳定转化，瞬时 + 稳定转化通用。

4. 自带潮霉素植物筛选标记

T-DNA 内嵌潮霉素抗性，转基因后代可通过潮霉素平板 / 基质筛选纯合株，不用额外构建抗性载体，一步完成阳性株筛选。

5. 载体改造便捷

双报告单元可单独酶切替换：替换 35S 启动子→启动子活性分析；替换报告基因→目的基因过表达，剩余另一个报告保留用于转基因阳性示踪，降低后续鉴定工作量。

三、实验室主流应用实例

（1）植物遗传转化体系优化（原始开发用途）

烟草 / 拟南芥 / 毛状根转化方法摸索：通过 GFP 瞬时荧光统计侵染效率，GUS 染色统计稳定整合效率，快速优化侵染菌液浓度、侵染时间、共培养条件，是新物种转化体系建立标配载体。

实例：花生、苜蓿毛状根发根体系建立，国内油料作物课题组高频使用。

（2）启动子时空表达模式分析

切除载体原有 35S，待测内源启动子分别驱动 GFP/GUSPlus：

• GFP：活体看整株组织表达部位（根 / 茎 / 叶 / 花）；

• GUS 切片：显微水平看单细胞 / 器官特异表达，广泛用于基因启动子克隆、顺式元件功能验证、miRNA 靶向调控研究。

实例：水稻 OsSPL、拟南芥开花基因 SOC1 启动子表达谱解析。

（3）基因过表达 + 转基因株系鉴定

去掉其中一个报告基因插入目的基因，剩余报告（GFP/GUS）作为转基因示踪标记：潮霉素筛苗 + 荧光 / GUS 染色双重验证阳性，区分纯合 / 杂合转基因株，大幅减少 PCR 鉴定工作量。

实例：人参皂苷合成基因 PgSS1 在苜蓿毛状根过表达，用 GUS+GFP 双标鉴定发根阳性株。

（4）亚细胞定位与基因互作辅助验证

GFP 用于目的蛋白亚细胞荧光定位（叶绿体 / 细胞核 / 细胞膜），GUS 作为组织水平表达参照，排除载体表达干扰；常用于转录因子、酶蛋白的细胞定位试验。

（5）作物育种、病原互作研究

1. 抗病基因功能：过表达抗病基因，GFP/GUS 标记转基因株，接种病原菌观测抗病表型；

2. 根瘤共生：大豆根瘤菌侵染，GUS 染色观察根瘤组织基因表达，根瘤发育机理研究。

四、同 RUBY 系列载体对比小结

• pGFPGUSPlus：实验室机理研究首选（精细细胞定位 + 定量染色），适合启动子、基因功能基础科研；

• 35S-RUBY：大田裸眼筛选首选（肉眼红色），适合大批量转基因初筛、田间育种材料快速分选。

需要我整理酶切位点清单、常用改造方案吗？

pGFPGUSPlus (#64401) 酶切位点 + 常用改造方案

一、载体关键酶切位点（T-DNA 区，实用常用酶，避开骨架稀有酶）

载体全长≈13.7 kb，T-DNA 结构简式：

LB—Hygromycin（潮霉素）—35S::GFP-NOS — MCS 多克隆区 — 35S::GUSPlus-NOS — RB

1、GFP 前端 / 后端可用酶（替换 GFP、换启动子）

1. GFP 上游（35S 启动子 5’）

   XhoⅠ、EcoRⅠ：切除 CaMV35S，接入组织特异 / 内源启动子（种子 / 根 / 诱导型启动子）

2. GFP 下游（GFP 终止 NOS 前）

   BglⅡ、SpeⅠ：切除 GFP，插入目的基因做过表达，保留 GUSPlus 做报告标记

2、GUSPlus 表达盒上下游酶（改造 GUS 端）

SacⅠ、SmaⅠ：切掉 35S-GUSPlus，替换为待测基因，保留 GFP 作为阳性筛选标记

3、中间核心 MCS 多克隆位点（双报告之间空白位点，最常用插入位点）

KpnⅠ、BamHⅠ、NcoⅠ（高频通用）

优势：不破坏两侧 GFP、GUSPlus 完整表达框，适合插入外源片段、顺式元件、候选基因。

4、全载体稀有单切点（整载体骨架改造，全质粒唯一位点）

PstⅠ、XbaⅠ：全质粒仅 1 个酶切位点，用于大片段插入、骨架元件替换。

5、筛选标记区（潮霉素 Hyg）酶切

ClaⅠ：可切除潮霉素抗性，替换 Bar / 卡那抗性，适配小麦、玉米等除草剂筛选体系。

简易速记：

换启动子：XhoⅠ+EcoRⅠ；插目的基因：KpnⅠ+BamHⅠ；换筛选标记：ClaⅠ

二、三大主流实验室改造方案（科研最常用）

方案 1：启动子功能载体（最常用，启动子克隆课题标配）

改造思路：替换 GFP 上游 35S，待测启动子驱动 GFP，GUSPlus 维持 35S 不变做内参

1. 酶切：XhoⅠ+EcoRⅠ 双酶切载体，切掉原 35S；

2. 同源重组 / 连接：扩增目标启动子（两端加 XhoⅠ/EcoR 同源臂）；

3. 转化 DH5α，Kan 抗性筛菌；

4. 功能：

   GFP 看活体组织表达部位，GUSPlus 全株稳定染色做对照，排除载体本底干扰。

   适用：基因启动子、胁迫诱导启动子、组织特异性启动子分析。

方案 2：目的基因过表达载体（农学 / 基因功能刚需）

改造思路：删掉 GFP，目的基因插入 GFP 位置，保留 35S::GUSPlus 作为转基因报告

1. 酶切：BglⅡ+SpeⅠ 切掉 GFP 完整片段；

2. 目的基因扩增，两端加对应酶切位点；

3. 连接构建，潮霉素为植物筛选标记；

4. 检测：转基因材料 GUS 染色鉴定阳性，不用频繁 PCR。

方案 3：双报告拆分改造（单报告载体构建）

1. 单 GFP 载体：SacⅠ+SmaⅠ 切除 GUSPlus 表达盒，仅保留 35S-GFP+Hyg；

2. 单 GUSPlus 载体：XhoⅠ+EcoR 切除 GFP 表达盒，仅保留 35S-GUSPlus+Hyg；

   适用：只需要单一荧光 / 染色的简易转化实验，降低载体长度，提升转化效率。

三、配套小实验方案（瞬时表达验证）

1. 构建好的重组质粒转化 GV3101；

2. 本氏烟草注射，2~3 d：

• 体视荧光镜观察 GFP 绿色荧光（活体无损）；

• 取样浸泡 X-Gluc 染色液，37℃过夜显色，GUS 蓝斑精细定位。

四、和 35S-RUBY 改造区别简记

• pGFPGUSPlus：靠酶切换启动子 / 基因，双报告精准细胞定位，机理实验；

• 35S-RUBY：多直接切下完整 RUBY 表达框，插入 CRISPR 骨架做肉眼筛选，育种转化