35S:RUBY (Plasmid #160908)-裸眼显色报告二元载体（pHDE 骨架）-植物报告质粒

Backbone

• Vector backbone

  pHDE

• Backbone size w/o insert (bp)9346

• Total vector size (bp)14237

• Vector type

  Plant Expression

Growth in Bacteria

• Bacterial Resistance(s)

  Spectinomycin, 50 μg/mL

• Growth Temperature

  37°C

• Growth Strain(s)

  DH5alpha

• Copy number

  Unknown

Gene/Insert

• Gene/Insert name

  RUBY and CaMV 35S promoter

• Species

  Synthetic; Cauliflower mosaic virus

• Insert Size (bp)

  4892

• PromoterCaMV 35S

Cloning Information

• Cloning methodGibson Cloning

• 5′ sequencing primerCCTGTCAAACACTGATAGTTTtgagacttttcaacaaagggt

• 3′ sequencing primerGCTTACTCAGTTAGGTCTAGCTTATCTTTAATCATATTCCATAGTCCA

• (Common Sequencing Primers)

Resource Information

• Articles Citing this Plasmid

• 20 References

Terms and Licenses

• Academic/Nonprofit Terms

• UBMTA

• Industry Terms

• Not Available to Industry

Trademarks:

• Zeocin® is an InvivoGen trademark.

How to cite this plasmid( Back to top)

These plasmids were created by your colleagues. Please acknowledge the Principal Investigator, cite the article in which the plasmids were described, and include Addgene in the Materials and Methods of your future publications.

• For your Materials & Methods section:

  35S:RUBY was a gift from Yunde Zhao (Addgene plasmid # 160908 ; http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908)

• For your References section:

  A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. He Y, Zhang T, Sun H, Zhan H, Zhao Y. Hortic Res. 2020 Sep 19;7:152. doi: 10.1038/s41438-020-00390-1. eCollection 2020. 10.1038/s41438-020-00390-1 PubMed 33024566

• 载体名称:

• 35S:RUBY

• 载体抗性:

• Spectinomycin

• 载体长度:

• 14335 bp

• 载体类型:

• Plant Expression

• 复制子:

• ori

• 宿主:

• Plants

• 启动子:

• CaMV 35S (enhanced)

• 克隆方法:

• Gibson Cloning

• 5'引物:

• CCTGTCAAACACTGATAGTTTtgagacttttcaacaaagggt

• 3'引物:

• GCTTACTCAGTTAGGTCTAGCTTATCTTTAATCATATTCCATAGTCCA

• 感受态:

• Stbl3

• 培养温度:

• 37℃

• 序列gtccagaaccttgaccgaacgcagcggtggtaacggcgcagtggcggttttcatggcttgttatgactgtttttttggggtacagtctatgcctcgggcatccaagcagcaagcgcgttacgccgtgggtcgatgtttgatgttatggagcagcaacgatgttacgcagcagggcagtcgccctaaaacaaagttaaacatcatgggggaagcggtgatcgccgaagtatcgactcaactatcagaggtagttggcgtcatcgagcgccatctcgaaccgacgttgctggccgtacatttgtacggctccgcagtggatggcggcctgaagccacacagtgatattgatttgctggttacggtgaccgtaaggcttgatgaaacaacgcggcgagctttgatcaacgaccttttggaaacttcggcttcccctggagagagcgagattctccgcgctgtagaagtcaccattgttgtgcacgacgacatcattccgtggcgttatccagctaagcgcgaactgcaatttggagaatggcagcgcaatgacattcttgcaggtatcttcgagccagccacgatcgacattgatctggctatcttgctgacaaaagcaagagaacatagcgttgccttggtaggtccagcggcggaggaactctttgatccggttcctgaacaggatctatttgaggcgctaaatgaaaccttaacgctatggaactcgccgcccgactgggctggcgatgagcgaaatgtagtgcttacgttgtcccgcatttggtacagcgcagtaaccggcaaaatcgcgccgaaggatgtcgctgccgactgggcaatggagcgcctgccggcccagtatcagcccgtcatacttgaagctagacaggcttatcttggacaagaagaagatcgcttggcctcgcgcgcagatcagttggaagaatttgtccactacgtgaaaggcgagatcaccaaggtagtcggcaaataatgtctagctagaaattcgttcaagccgacgccgcttcgcggcgcggcttaactcaagcgttagatgcactaagcacataattgctcacagccaaactatcaggtcaagtctgcttttattatttttaagcgtgcataataagccctacacaaattgggagatatatcatgcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagggtgccttgatgtgggcgccggcggtcgagtggcgacggcgcggcttgtccgcgccctggtagattgcctggccgtaggccagccatttttgagcggccagcggccgcgataggccgacgcgaagcggcggggcgtagggagcgcagcgaccgaagggtaggcgctttttgcagctcttcggctgtgcgctggccagacagttatgcacaggccaggcgggttttaagagttttaataagttttaaagagttttaggcggaaaaatcgccttttttctcttttatatcagtcacttacatgtgtgaccggttcccaatgtacggctttgggttcccaatgtacgggttccggttcccaatgtacggctttgggttcccaatgtacgtgctatccacaggaaagagaccttttcgacctttttcccctgctagggcaatttgccctagcatctgctccgtacattaggaaccggcggatgcttcgccctcgatcaggttgcggtagcgcatgactaggatcgggccagcctgccccgcctcctccttcaaatcgtactccggcaggtcatttgacccgatcagcttgcgcacggtgaaacagaacttcttgaactctccggcgctgccactgcgttcgtagatcgtcttgaacaaccatctggcttctgccttgcctgcggcgcggcgtgccaggcggtagagaaaacggccgatgccgggatcgatcaaaaagtaatcggggtgaaccgtcagcacgtccgggttcttgccttctgtgatctcgcggtacatccaatcagctagctcgatctcgatgtactccggccgcccggtttcgctctttacgatcttgtagcggctaatcaaggcttcaccctcggataccgtcaccaggcggccgttcttggccttcttcgtacgctgcatggcaacgtgcgtggtgtttaaccgaatgcaggtttctaccaggtcgtctttctgctttccgccatcggctcgccggcagaacttgagtacgtccgcaacgtgtggacggaacacgcggccgggcttgtctcccttcccttcccggtatcggttcatggattcggttagatgggaaaccgccatcagtaccaggtcgtaatcccacacactggccatgccggccggccctgcggaaacctctacgtgcccgtctggaagctcgtagcggatcacctcgccagctcgtcggtcacgcttcgacagacggaaaacggccacgtccatgatgctgcgactatcgcgggtgcccacgtcatagagcatcggaacgaaaaaatctggttgctcgtcgcccttgggcggcttcctaatcgacggcgcaccggctgccggcggttgccgggattctttgcggattcgatcagcggccgcttgccacgattcaccggggcgtgcttctgcctcgatgcgttgccgctgggcggcctgcgcggccttcaacttctccaccaggtcatcacccagcgccgcgccgatttgtaccgggccggatggtttgcgaccgctcacgccgattcctcgggcttgggggttccagtgccattgcagggccggcagacaacccagccgcttacgcctggccaaccgcccgttcctccacacatggggcattccacggcgtcggtgcctggttgttcttgattttccatgccgcctcctttagccgctaaaattcatctactcatttattcatttgctcatttactctggtagctgcgcgatgtattcagatagcagctcggtaatggtcttgccttggcgtaccgcgtacatcttcagcttggtgtgatcctccgccggcaactgaaagttgacccgcttcatggctggcgtgtctgccaggctggccaacgttgcagccttgctgctgcgtgcgctcggacggccggcacttagcgtgtttgtgcttttgctcattttctctttacctcattaactcaaatgagttttgatttaatttcagcggccagcgcctggacctcgcgggcagcgtcgccctcgggttctgattcaagaacggttgtgccggcggcggcagtgcctgggtagctcacgcgctgcgtgatacgggactcaagaatgggcagctcgtacccggccagcgcctcggcaacctcaccgccgatgcgcgtgcctttgatcgcccgcgacacgacaaaggccgcttgtagccttccatccgtgacctcaatgcgctgcttaaccagctccaccaggtcggcggtggcccatatgtcgtaagggcttggctgcaccggaatcagcacgaagtcggctgccttgatcgcggacacagccaagtccgccgcctggggcgctccgtcgatcactacgaagtcgcgccggccgatggccttcacgtcgcggtcaatcgtcgggcggtcgatgccgacaacggttagcggttgatcttcccgcacggccgcccaatcgcgggcactgccctggggatcggaatcgactaacagaacatcggccccggcgagttgcagggcgcgggctagatgggttgcgatggtcgtcttgcctgacccgcctttctggttaagtacagcgataaccttcatgcgttccccttgcgtatttgtttatttactcatcgcatcatatacgcagcgaccgcatgacgcaagctgttttactcaaatacacatcacctttttagacggcggcgct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35S:RUBY（Addgene #160908）质粒特点、原理与应用分析

一、质粒基础信息

质粒编号：Addgene #160908，Zhao Yunde 实验室构建（2020，Horticulture Research）

骨架载体：pHDE 二元植物载体，空载骨架 9346 bp，全质粒总长14237 bp，T-DNA 区携带 35S::RUBY 表达盒，RUBY 插入片段 4892 bp

原核筛选：壮观霉素 (Spectinomycin,50μg/mL)，大肠杆菌 DH5α/ 农杆菌 GV3101 培养，37℃高拷贝复制

启动子：组成型强启动子CaMV 35S；终止子：NOS 终止子

载体类型：农杆菌介导植物二元表达载体（T-DNA 整合基因组）

二、RUBY 报告基因核心原理

RUBY 是人工合成多顺反子报告元件，依靠 2A 自剪切肽串联 3 个甜菜碱合成关键酶：CYP76AD1+DODA + 葡萄糖基转移酶 (GT)：

内源酪氨酸（植物细胞天然存在，无需外源添加底物）→CYP76AD1 催化生成 L-DOPA；

L-DOPA 经 DODA 生成甜菜醛氨酸、CYP76AD1 生成环多巴；二者自发缩合生成甜菜素；

GT 糖基化生成甜菜红素（鲜红色），肉眼直接显色，无需荧光显微镜、底物显色、组织化学染色。

对比 GFP/mCherry（荧光设备）、GUS（X-Gluc 底物）、LUC（荧光素）：RUBY 裸眼可视、无创活体观测是最大优势。

三、质粒核心结构特点

1. 表达元件优势

35S 强组成型启动子：双子叶 / 单子叶通用，全组织、全生育期持续高效表达 RUBY，瞬时 / 稳定转化均可快速显色（烟草注射 48h 出红斑、拟南芥侵染 2d 见红斑）；

2A 串联单 ORF 设计：3 个酶共用一套启动子 - 终止子，片段紧凑、无多余冗余序列，便于亚克隆改造载体；

T-DNA 标准二元骨架：RB-LB 边界完整，农杆菌侵染后 T-DNA 精准插入植物基因组，转基因稳定遗传、红色性状可随种子传递（转基因种子深红色）。

2. 筛选与检测优势

✅ 无创活体筛选：愈伤、组培苗、种子、田间成株直接肉眼挑红，淘汰阴性，大幅节省抗性筛选培养基成本；

✅ 色素不跨细胞转运：红色严格局限在转基因细胞，不会扩散污染周边组织，定位精准；

✅ 可定量检测：甜菜红素溶于水，提取上清测 OD535，实现基因表达水平半定量 / 精确定量。

3. 短板局限性

35S 超强表达，部分木本植物（杨树）愈伤高表达 RUBY 会抑制芽分化，不适宜再生困难树种的稳定遗传转化；

甜菜碱合成依赖胞内酪氨酸，极端缺酪氨酸胁迫环境显色减弱；

无内置植物抗性标记（潮 / 卡那），仅靠显色筛选，构建双标载体需额外插入抗性基因。

四、科研应用场景

1. 植物遗传转化可视化筛选（最主流用途）

稳定转基因植株快速筛选：拟南芥浸花、水稻 / 玉米愈伤转化、棉花 / 大豆组培，红愈伤 / 红苗直接判定阳性，省去抗生素筛选，缩短育种周期；转基因种子凭红色肉眼分拣（拟南芥 T1 代红籽 = 阳性）；

发根农杆菌毛状根转化：大豆、烟草、苜蓿毛根培养，20 天肉眼挑红根，无组培即可快速获得转基因根系，用于根系基因功能、根瘤 / 根际微生物互作研究；

瞬时表达快速验证：烟草叶片农杆菌浸润、子叶瞬时转化，48h 显色，快速验证启动子活性、载体表达效率（CRISPR 载体改造标配报告）。

2. CRISPR 基因编辑配套筛选系统

作为编辑阳性可视化标记：将 35S:RUBY 插入 pKSE401、pRGEB32 等 CRISPR 骨架，编辑成功的细胞变红，快速筛选基因编辑愈伤 / 植株，大幅提升基因编辑阳性株筛选效率，国内水稻、玉米、果蔬编辑体系广泛改造使用；

基因编辑教学材料：本科生实验用 RUBY 载体定点敲除 / 修复，肉眼红白斑直观展示 CRISPR 编辑效果。

3. RNA 沉默（VIGS/RNAi）定量研究

RUBY 显色强度与基因沉默程度负相关：沉默 RUBY 相关酶基因→红色变浅 / 消失，依靠色素吸光值快速量化沉默效率，不用荧光 / 底物，低成本高通量筛选沉默载体。

4. 启动子功能与基因表达示踪

以 35S:RUBY 为模板，扩增 RUBY 表达框，替换 35S 为待测内源启动子，构建启动子 - RUBY 载体，通过红色分布直观观察启动子组织特异性（根 / 叶 / 花 / 种子特异表达）；

双报告系统构建：35S:RUBY+35S:eYGFPuv，同一细胞同时红 + 绿显色，荧光 + 裸眼双重标记，用于亚细胞 / 组织共定位研究。

5. 园艺育种、观赏性状创制

异源过表达 RUBY 培育全红叶片、红色花瓣观赏植株，用于花卉、果蔬新种质创制；探究甜菜碱代谢通路，辅助花青素 / 甜菜碱代谢工程育种。

五、载体衍生改造方向

替换启动子：UBQ、Ubi、组织特异启动子（种子 / 根特异），衍生 UBQ:RUBY（#160909）等系列载体Addgene；

加装植物筛选标记：插入 Kan/Hyg/Bar 抗性，实现 “抗性 + 显色” 双重筛选（Addgene#245490 由本载体改造而来）；

Golden Gate 模块化：RUBY 单独切出作为标准报告模块，任意插入各类超表达、敲除载体。

需要我整理RUBY 上下游测序引物、常用酶切位点清单或载体简化速记版总结吗？

35S:RUBY质粒的应用实例

35S:RUBY (#160908) 质粒落地应用实例

拟南芥全株红转化苗

红宝石水稻籽粒

一、稳定转基因裸眼筛选（最经典应用，原文献 Zhao 实验室首发）

1. 拟南芥浸花转化（模式植物标杆案例）

将 35S:RUBY 转入 GV3101，农杆菌浸花侵染野生型拟南芥：

T0 代收种，红色籽粒 = 阳性转基因种子，肉眼直接分拣，不用卡那霉素平板筛选；

T1 全株叶片、茎、花通体鲜红，分离后代红籽：白籽符合孟德尔 3:1 分离，用来验证转基因单拷贝插入；

原始文献：Horticulture Research 2020（RUBY 首发论文）。

2. 水稻、玉米稳定愈伤筛选

籼稻遗传转化优化（2026，生物通）：籼稻 Ranjit、Kon Joha 未成熟胚愈伤转化，愈伤长出鲜红色斑块即阳性，快速筛选最优 2,4-D、分化激素配比，统计转化效率，替代潮霉素筛选；

华南农大红宝石水稻育种衍生：以 35S-RUBY 骨架改造胚乳特异启动子 RUBY，培育全红胚乳 “红宝石米”，富含甜菜红素抗氧化功能性稻米种质；

玉米：35S/ZmUBI 替换驱动 RUBY，愈伤、再生苗红色标记，筛选转基因玉米株系。

3. 蔬菜（生菜 / 番茄 / 辣椒）组培筛选

生菜（PMC 2025）：35S:RUBY 转化两种生菜愈伤，红愈伤占比 54%~58%，对比 UBI 启动子 RUBY 显色效率，评价不同启动子在蔬菜再生中的表达稳定性；

辣椒（岳麓山实验室，邹学校院士团队）：改造 pKSE401-CRISPR+35S:RUBY，辣椒子叶瞬时 48h 见红，T0 代再生苗红色即为基因编辑阳性株，编辑效率可达 100%，攻克辣椒转化难痛点；

番茄（Vegetable Research 2026）：利用 RUBY 红色深浅量化转基因表达强弱，快速筛选单拷贝、无沉默的稳定转基因番茄株系。

二、CRISPR 基因编辑可视化筛选（国内育种最常用改造方案）

实例 1：pKSE401-Cas9+35S:RUBY 编辑载体（湖南农大 / 岳麓山实验室）

将 35S:RUBY 表达框插入 Cas9 骨架，烟草叶片农杆菌注射 48h 局部变红，辣椒子叶 72h 显色；变红外植体 = Cas9 成功表达，大概率发生基因编辑，不用 PCR 初筛，大幅降低测序成本，已用于辣椒 PDS、抗病基因批量敲除。

实例 2：黑麦草 / 牧草 CRISPR 靶点预筛

多年生黑麦草 PDS 基因敲除载体搭载 35S:RUBY，愈伤显红色→后续再生白化苗（PDS 敲除表型），用 RUBY 显色预判靶点编辑可行性，优化 LbCas12a 编辑系统。

实例 3：高校实验教学 CRISPR 实训（Plant Physiology 2025）

全球高校开课项目：RUBY 碱基修复编辑教学实验，烟草瞬时转化，成功修复突变 RUBY 则叶片变红，直观肉眼看编辑成败，5 天完成整套 CRISPR 实操课程。

三、发根农杆菌毛状根（Hairy root）转化高频实例（大豆 / 木本 / 药用植物）

1. 大豆毛根（应用最成熟体系，多篇 Frontiers/PMC）

大豆疫霉抗病研究：Williams82、HN66 大豆子叶侵染 K599（含 35S:RUBY），2 周挑鲜红色毛根，在红根中过表达黄酮合成基因 GmCHS7/GmC4H，接种大豆疫霉菌，观测根系侵染程度，解析黄酮抑制病原菌入侵机制；

大豆基因靶点快速初筛：利用红毛根快速验证 GmWRKY、GmPDS 编辑效率，毛根数据可预判大田稳定株编辑表型，省去漫长组培再生。

2. 木本 & 药用植物

文冠果：下胚轴诱导红毛根，筛选最优 K599 菌株，阳性发根率 51.64%，用于油脂合成基因功能验证；

樱草（报春花）：红毛根诱导体细胞胚胎再生完整转基因植株，研究花柱异型、自交不亲和关键 S 位点基因，同时毛根生物反应器生产抗癌皂苷；

油桐：毛根红色标记筛选阳性根系，研究油脂代谢通路关键酶基因。

3. 豆科根瘤共生研究

苜蓿 / 百脉根红毛根结瘤试验：转基因红根系正常形成根瘤，直观区分转基因 / 野生型根系，研究根瘤菌固氮相关基因功能。

四、VIGS 病毒介导基因沉默定量检测（RNA 沉默科研标配）

烟草 TRV-VIGS 沉默定量体系（Plant Mol Biol 2024）

共注射：35S:RUBY + TRV 沉默载体

若沉默 RUBY 上游酪氨酸合成基因→叶片红色变浅 / 发白；

甜菜红素水溶提取测 OD535，吸光值量化沉默效率，不用 qPCR 粗筛；

配套 P19 沉默抑制子，对比沉默强弱，高通量筛选沉默载体，成为 VIGS 标准化报告系统。

五、瞬时表达载体效率验证（载体构建必做初筛）

本氏烟草快速验证：新构建超表达 / 启动子载体与 35S:RUBY 共注射，48h 显色，验证农杆菌侵染活性、载体 T-DNA 完整性，是载体测序后体外功能初筛金标准；

杨树、棉花瞬时测试：35S:RUBY 瞬时侵染杨树叶，验证双子叶木本侵染条件，优化农杆菌 OD、乙酰丁香酮浓度。

六、启动子克隆与表达模式分析、双标载体构建

1. 内源启动子功能分析

以 35S:RUBY 为模板扩增 RUBY 片段，替换 35S 为待测启动子：

种子特异启动子 At2S3::RUBY：植株茎叶无色、仅种子鲜红，直观证明启动子种子特异性；

根特异 / 花特异启动子替换后，红色只在对应器官出现，无损观察表达谱。

2. 红绿双标载体（RUBY+eYGFPuv）

构建 35S:RUBY+35S: 荧光双报告，同一细胞红色 + 绿色双显色，活体组织共定位，用于亚细胞定位、细胞谱系示踪（病毒 Cre 重组酶细胞追踪）。

七、园艺育种新种质创制

花卉：矮牵牛、月季瞬时 / 稳定转化 35S:RUBY，获得全红叶片、红色花瓣新品系；

果蔬：彩色生菜、红果肉番茄新材料创制，利用甜菜红素天然色素改良果蔬营养与外观。