pKjk5::GFP 广宿主细菌荧光蛋白开关（检测质粒水平基因转移）

产品介绍

pKJK5::GFP（广宿主细菌荧光开关质粒）

它是在野生型广宿主接合质粒 pKJK5（IncP‑1ε，54 kb） 上，插入 LacIq 抑制型 GFP 表达盒的改造株；核心是 **“供体不绿、转移后受体变绿” 的荧光开关 **，专门用来可视化 + 定量检测质粒水平基因转移（HGT）。

一、质粒基本信息

• 骨架：pKJK5（AM261282），IncP‑1ε，54,383 bp，低拷贝、自主接合、极广宿主（α/γ‑变形菌：大肠杆菌、假单胞菌、农杆菌、根瘤菌等）。

• 抗性标记：

• 野生型：Tet（四环素）+ Tmp（甲氧苄啶）。

• 改造型 pKJK5::GFP：加 Kmʳ（卡那霉素）。

• 荧光开关元件（关键）：

• gfpmut3b：高亮度 GFP。

• 启动子：Pₐ₁/O₄/O₃（强启动子，LacIq 严格抑制）。

• 调控逻辑：LacIq 存在→GFP 关闭；LacIq 消失→GFP 开启。

二、荧光开关原理（HGT 检测核心）

采用双标签系统（Donor⁺/Recipient⁻）：

1. 供体菌株（Donor）

• 染色体上整合：lacIq（组成型表达抑制子）+ mCherry（红色荧光）+ Kmʳ（mini‑Tn7 插入）。

• 携带 pKJK5::GFP：GFP 被 LacIq 抑制→不发绿色荧光；只发红光。

2. 接合转移（HGT）

• pKJK5::GFP 通过 Tra1/Tra2 接合系统自主转移到受体菌（Recipient）。

3. 受体菌株（Transconjugant，接合子）

• 受体菌无 lacIq → GFP 去抑制→发绿色荧光。

• 表型：供体红、接合子绿、未转移受体无荧光，可直接区分。

三、为什么选 pKJK5::GFP（优势）

1. 宿主极广：覆盖环境 / 临床常见菌，适合土壤、污水、生物膜、肠道等复杂群落 HGT 研究。

2. 转移效率高：IncP‑1 型质粒接合能力强，环境中高频转移，易检测。

3. 开关严谨：LacIq 抑制 leak 极低，背景荧光几乎为零，信噪比高。

4. 可定量 + 原位可视化：

• 荧光显微镜：直接看空间分布。

• 流式细胞术（FACS）：精准计数供体（红）/ 接合子（绿），计算转移频率（接合子数 / 供体数）。

• FACS 分选：获取接合子，做 16S 测序，鉴定接收质粒的野生菌种类。

四、常用实验方案（标准流程）

1. 供体：E. coli MG1655::lacIq‑mCherry‑Kmʳ + pKJK5::GFP（Tet⁺Km⁺，红光）。

2. 受体：环境菌群 / 野生菌株（无 lacIq，无荧光）。

3. 接合：1:1 混合，滤膜 mating，30℃ 孵育 16–20 h。

4. 检测：

• 荧光显微镜：红 = 供体，绿 = 接合子。

• FACS：统计绿 / 红比例 = 转移频率。

• 平板计数：Tet+Rif 筛选接合子，Tet 计数供体。

五、改造版本（按需选）

• pKJK5::gfp（基础版）：GFP+Km，Tet+Tmp，最常用。

• pKJK5::gfpPL：GFP+Cas9+sgRNA，可同时做 HGT 检测与基因编辑。

• pKJK5‑attTn7：插入 attTn7 位点，方便后续克隆其他基因。

六、获取与构建（长沙 / 国内）

• Addgene：搜 pKJK5::GFP，多为 Klümper 实验室版本（如 #12345）。

七、关键登录号与序列

• pKJK5 野生型：AM261282（54,383 bp）。

• pKJK5::GFP 改造型：无统一登录号，参考 Klümper 2015 文献（OP921802 为 CRISPR 改造版）。

• 
  

pKJK5::GFP 是广宿主、高转移、严开关的 HGT 金标准工具；通过红 / 绿荧光区分供体 / 接合子，实现原位可视化 + 精准定量，广泛用于环境微生物、抗性基因扩散、生物膜等研究。