pBI121-35S-Chlo-mCherry：

全序列：TGAGCGTCGCAAAGGCGCTCGGTCTTGCCTTGCTCGTCGGTGATGTACTTCACCAGCTCCGCGAAGTCGCTCTTCTTGATGGAGCGCATGGGGACGTGCTTGGCAATCACGCGCACCCCCCGGCCGTTTTAGCGGCTAAAAAAGTCATGGCTCTGCCCTCGGGCGGACCACGCCCATCATGACCTTGCCAAGCTCGTCCTGCTTCTCTTCGATCTTCGCCAGCAGGGCGAGGATCGTGGCATCACCGAACCGCGCCGTGCGCGGGTCGTCGGTGAGCCAGAGTTTCAGCAGGCCGCCCAGGCGGCCCAGGTCGCCATTGATGCGGGCCAGCTCGCGGACGTGCTCATAGTCCACGACGCCCGTGATTTTGTAGCCCTGGCCGACGGCCAGCAGGTAGGCCGACAGGCTCATGCCGGCCGCCGCCGCCTTTTCCTCAATCGCTCTTCGTTCGTCTGGAAGGCAGTACACCTTGATAGGTGGGCTGCCCTTCCTGGTTGGCTTGGTTTCATCAGCCATCCGCTTGCCCTCATCTGTTACGCCGGCGGTAGCCGGCCAGCCTCGCAGAGCAGGATTCCCGTTGAGCACCGCCAGGTGCGAATAAGGGACAGTGAAGAAGGAACACCCGCTCGCGGGTGGGCCTACTTCACCTATCCTGCCCGGCTGACGCCGTTGGATACACCAAGGAAAGTCTACACGAACCCTTTGGCAAAATCCTGTATATCGTGCGAAAAAGGATGGATATACCGAAAAAATCGCTATAATGACCCCGAAGCAGGGTTATGCAGCGGAAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCAGAAGGCCGCCAGAGAGGCCGAGCGCGGCCGTGAGGCTTGGACGCTAGGGCAGGGCATGAAAAAGCCCGTAGCGGGCTGCTACGGGCGTCTGACGCGGTGGAAAGGGGGAGGGGATGTTGTCTACATGGCTCTGCTGTAGTGAGTGGGTTGCGCTCCGGCAGCGGTCCTGATCAATCGTCACCCTTTCTCGGTCCTTCAACGTTCCTGACAACGAGCCTCCTTTTCGCCAATCCATCGACAATCACCGCGAGTCCCTGCTCGAACGCTGCGTCCGGACCGGCTTCGTCGAAGGCGTCTATCGCGGCCCGCAACAGCGGCGAGAGCGGAGCCTGTTCAACGGTGCCGCCGCGCTCGCCGGCATCGCTGTCGCCGGCCTGCTCCTCAAGCACGGCCCCAACAGTGAAGTAGCTGATTGTCATCAGCGCATTGACGGCGTCCCCGGCCGAAAAACCCGCCTCGCAGAGGAAGCGAAGCTGCGCGTCGGCCGTTTCCATCTGCGGTGCGCCCGGTCGCGTGCCGGCATGGATGCGCGCGCCATCGCGGTAGGCGAGCAGCGCCTGCCTGAAGCTGCGGGCATTCCCGATCAGAAATGAGCGCCAGTCGTCGTCGGCTCTCGGCACCGAATGCGTATGATTCTCCGCCAGCATGGCTTCGGCCAGTGCGTCGAGCAGCGCCCGCTTGTTCCTGAAGTGCCAGTAAAGCGCCGGCTGCTGAACCCCCAACCGTTCCGCCAGTTTGCGTGTCGTCAGACCGTCTACGCCGACCTCGTTCAACAGGTCCAGGGCGGCACGGATCACTGTATTCGGCTGCAACTTTGTCATGCTTGACACTTTATCACTGATAAACATAATATGTCCACCAACTTATCAGTGATAAAGAATCCGCGCGTTCAATCGGACCAGCGGAGGCTGGTCCGGAGGCCAGACGTGAAACCCAACATACCCCTGATCGTAATTCTGAGCACTGTCGCGCTCGACGCTGTCGGCATCGGCCTGATTATGCCGGTGCTGCCGGGCCTCCTGCGCGATCTGGTTCACTCGAACGACGTCACCGCCCACTATGGCATTCTGCTGGCGCTGTATGCGTTGGTGCAATTTGCCTGCGCACCTGTGCTGGGCGCGCTGTCGGATCGTTTCGGGCGGCGGCCAATCTTGCTCGTCTCGCTGGCCGGCGCCAGATCTGGGGAACCCTGTGGTTGGCATGCACATACAAATGGACGAACGGATAAACCTTTTCACGCCCTTTTAAATATCCGATTATTCTAATAAACGCTCTTTTCTCTTAGGTTTACCCGCCAATATATCCTGTCAAACACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGATCATGAGCGGAGAATTAAGGGAGTCACGTTATGACCCCCGCCGATGACGCGGGACAAGCCGTTTTACGTTTGGAACTGACAGAACCGCAACGTTGAAGGAGCCACTCAGCCGCGGGTTTCTGGAGTTTAATGAGCTAAGCACATACGTCAGAAACCATTATTGCGCGTTCAAAAGTCGCCTAAGGTCACTATCAGCTAGCAAATATTTCTTGTCAAAAATGCTCCACTGACGTTCCATAAATTCCCCTCGGTATCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCAATCCAAATAATCTGCACCGGATCTGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGATGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACGGGATCTCTGCGGAACAGGCGGTCGAAGGTGCCGATATCATTACGACAGCAACGGCCGACAAGCACAACGCCACGATCCTGAGCGACAATATGATCGGGCCCGGCGTCCACATCAACGGCGTCGGCGGCGACTGCCCAGGCAAGACCGAGATGCACCGCGATATCTTGCTGCGTTCGGATATTTTCGTGGAGTTCCCGCCACAGACCCGGATGATCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGCCTCCTGTCAATGCTGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGCGGCTCTGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGCTCTGAGGGAGGCGGTTCCGGTGGTGGCTCTGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAAAAGATGGCAAACGCTAATAAGGGGGCTATGACCGAAAATGCCGATGAAAACGCGCTACAGTCTGACGCTAAAGGCAAACTTGATTCTGTCGCTACTGATTACGGTGCTGCTATCGATGGTTTCATTGGTGACGTTTCCGGCCTTGCTAATGGTAATGGTGCTACTGGTGATTTTGCTGGCTCTAATTCCCAAATGGCTCAAGTCGGTGACGGTGATAATTCACCTTTAATGAATAATTTCCGTCAATATTTACCTTCCCTCCCTCAATCGGTTGAATGTCGCCCTTTTGTCTTTGGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCCCCAGATTAGCCTTTTCAATTTCAGA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pBI121-35S-Chlo-mCherry（叶绿体定位樱桃红色荧光载体）：

载体全称释义：经典农杆菌双元植物载体 pBI121 骨架 + CaMV35S 组成型强启动子 + Chlo 叶绿体转运肽（cTP） + mCherry 樱桃红色单体荧光蛋白；功能：植物全组织组成型表达、mCherry 特异性靶向叶绿体基质，活体荧光示踪叶绿体。

pBI121载体图谱

叶绿体蛋白转运模式图

一、载体各元件分步解析

1. pBI121 载体骨架（农杆菌双元 Ti 衍生载体，总长≈13603 bp）

pBI121 是植物转基因最经典双元载体，分 **T-DNA 转移区（整合入植物基因组）+ 质粒骨架区（细菌复制筛选）** 两大模块：

1. T-DNA 区（RB-RB 边界之间，转基因功能核心）

• RB（右边界）+ LB（左边界）：农杆菌 Vir 蛋白识别切割位点，只有两边界间 DNA 被转入植物细胞核并整合染色体；

• NPTⅡ（卡那霉素抗性基因）：NOS 启动子驱动，植物筛选标记，转基因植株可在含 Kan/G418 培养基存活；

• 目的表达盒：35S→Chlo→mCherry→NOS 终止子（本载体改造位点，替换原始 GUS 基因）。

2. 载体骨架区（T-DNA 外侧，原核操作）

• Kanᵣ原核抗性：大肠杆菌 / 农杆菌筛选；oriV/ColE1 复制子：质粒在细菌中自主复制扩增。

2. CaMV 35S 启动子（花椰菜花叶病毒强组成型启动子）

• 表达特性：全植物组织（根、茎、叶、花、愈伤）不受时空诱导、持续高效转录，组成型过表达下游融合基因，是植物最通用强启动子；

• 优势：单子叶 / 双子叶植物通用性强，不用诱导剂即可稳定表达 mCherry。

3. Chlo：叶绿体 N 端转运肽（Chloroplast Transit Peptide，cTP）【叶绿体定位关键元件】

（1）结构特点

Chlo 为核编码叶绿体蛋白的 N 端信号肽（25~100 aa），富含丝氨酸 / 丙氨酸，无保守氨基酸序列但理化特征保守（亲水 N 端、疏水中间区）。

（2）靶向转运机理（决定 mCherry 只进叶绿体）

1. 融合蛋白Chlo-mCherry 在细胞质核糖体翻译为前体蛋白；

2. 分子伴侣（Hsp70/Hsp90）结合前体，维持未折叠构象，引导至叶绿体外被膜；

3. 叶绿体外膜TOC 复合体 + 内膜 TIC 转运复合体特异性识别 Chlo 序列，牵引整条多肽跨双层膜进入叶绿体基质；

4. 基质内SP 蛋白酶切除 N 端 Chlo 转运肽，成熟单体 mCherry 滞留叶绿体基质，游离胞质无荧光。

补充：若无 Chlo，mCherry 游离细胞质 / 细胞核；加 Chlo 实现100% 叶绿体专一标记。

4. mCherry 樱桃红色荧光蛋白（报告基因，2004 年由 DsRed 定向进化获得）

（1）基础荧光参数

• 最大激发波长：587 nm；最大发射波长：610 nm（樱桃红色荧光）；

• 单体蛋白（m=monomer）：无四聚体聚集，融合标签不干扰靶蛋白构象（对比野生 DsRed 四聚体易蛋白聚集）。

（2）核心实验优势（植物叶绿体成像首选）

1. 成熟极快：荧光成熟半衰期≈15 min，转化后短时间可观测荧光；

2. 高光稳定性、抗光漂白：长时间激光共聚焦观测不易淬灭，优于 RFP、DsRed；

3. 低植物细胞毒性：不干扰叶绿体光合、发育；

4. 光谱和 GFP 无重叠：可与 GFP（绿）、CFP（蓝）做多色共标记，区分叶绿体 + 其他细胞器（线粒体 / 细胞膜）。

二、完整表达流程（从载体构建→植物转基因→荧光成像）

1. 原核构建：重组质粒转化 DH5α 大肠杆菌，Kan 抗性筛选、提质粒；

2. 农杆菌转化：质粒转入 GV3101/LBA4404 农杆菌，用于农杆菌介导植物侵染（叶盘法、浸花法）；

3. 植物转化：农杆菌 Vir 系统切割 T-DNA，35S-Chlo-mCherry 整合植物核基因组；

4. 体内翻译转运：35S 持续转录 mRNA→胞质合成 Chlo-mCherry 前体→Chlo 引导入叶绿体、切除信号肽→成熟 mCherry 在叶绿体发樱桃红荧光；

5. 检测：激光共聚焦显微镜，587 nm 激发，610 nm 采集红光，叶绿体自发荧光（叶绿素红光～680 nm）与 mCherry 荧光可分光区分。

三、载体科研应用场景

1. 叶绿体形态 / 发育示踪：活体观察叶绿体数量、大小、分裂、逆境胁迫（干旱、盐胁迫）下叶绿体形变；

2. 亚细胞共定位对照载体：和线粒体 Marker（mt-GFP）、质膜 Marker 共转，细胞器分区研究；

3. 叶绿体蛋白转运研究：待研究基因与 mCherry 互换，验证目的蛋白是否定位于叶绿体；

4. 转基因阳性植株快速初筛：不用 GUS 染色，活体叶片荧光快速筛选阳性株，无损检测；

5. 叶绿体代谢、光合相关基因功能验证。

四、优缺点总结

✅优点

1. pBI121 成熟稳定、农杆菌转化体系完善，双子叶（拟南芥、烟草、番茄）适用性极高；

2. 35S 广谱强表达 + Chlo 精准叶绿体靶向 + mCherry 优异光学性能，植物叶绿体活体成像金标准载体；

3. 红色发射远离叶绿素自荧光区间，背景干扰极低。

❌局限

1. 35S 组成型过量表达，高丰度 mCherry 长期积累可能轻微影响极端敏感型叶绿体突变株；

2. Chlo 多靶向叶绿体基质，若需类囊体 / 叶绿体内膜定位，需更换类囊体靶向信号肽。

五、同系列衍生载体区分

• pBI121-35S-mCherry（无 Chlo）：全细胞胞质 + 细胞核红色荧光；

• pBI121-35S-Chlo-mCherry：专一叶绿体基质荧光（本载体）；

• pBI121-35S-Mt-mCherry：线粒体定位红色 Marker。