mCh-Drp1
(Plasmid #49152)

• Purpose

  mammalian expression of Drp1 fused to mCherry

• Depositing Lab

  Gia Voeltz

• Publication

  Friedman et al Science. 2011 Oct 21;334(6054):358-62. doi: 10.1126/science.1207385. Epub 2011 Sep 1.( How to cite )

• Sequence Information

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Backbone

• Vector backbone

  mCh-alpha tubulin (Addgene plasmid )

• Backbone manufacturer

  Voeltz lab

• Vector type

  Mammalian Expression

• Selectable markers

  Neomycin (select with G418)

Growth in Bacteria

• Bacterial Resistance(s)

  Kanamycin, 50 μg/mL

• Growth Temperature

  37°C

• Growth Strain(s)

  DH5alpha

• Copy number

  Unknown

Gene/Insert

• Gene/Insert name

  Drp1

• Alt name

  DNM1L

• Alt name

  dynamin 1-like

• Alt name

  Drp1, isoform 3

• Species

  H. sapiens (human)

• GenBank ID

  NM_005690

• Entrez Gene

  DNM1L (a.k.a. DLP1, DRP1, DVLP, DYMPLE, EMPF, EMPF1, HDYNIV, OPA5)

• PromoterCMV

• Tag / Fusion Protein

• mCherry (N terminal on backbone)

Cloning Information

• Cloning methodRestriction Enzyme

• 5′ cloning siteXhoI (not destroyed)

• 3′ cloning siteBamHI (not destroyed)

• 5′ sequencing primermCherry-F (ccccgtaatgcagaagaaga)

• (Common Sequencing Primers)

Resource Information

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• 34 References

Terms and Licenses

• Academic/Nonprofit Terms

• UBMTA

• Industry Terms

• Not Available to Industry

Trademarks:

• Zeocin® is an InvivoGen trademark.

DRP1-mCherry（mCh-DRP1）质粒完整介绍

一、基础定义与核心元件

1. 全称与标准编号

通用名称：mCherry-DRP1（简写 mCh-DRP1）

Addgene 标准野生型质粒号：#49152（Gia Voeltz 实验室经典载体，线粒体动态研究金标准）

突变体衍生：mCherry-DRP1 K38A（#232350，GTP 酶失活突变）、S39A、S637A 等功能突变质粒

mCh-DRP1质粒图谱

DRP1-K38A质粒图谱

2. 融合蛋白结构

N 端 mCherry + Linker + 人源全长 DRP1（699 aa，isoform3，NP_005681）

• mCherry：单体红色荧光蛋白，激发 587 nm / 发射 610 nm，光稳定性强、低光漂白，适合活细胞长时间成像；无聚集，优于 DsRed 系列

• DRP1（Dynamin-Related Protein 1）：线粒体分裂核心 GTP 酶，分子量～80 kDa；胞质游离 / 线粒体膜定位双模式

• 柔性 Linker：避免荧光标签干扰 DRP1 寡聚、膜结合与 GTP 水解活性

3. 载体骨架关键信息

1. 表达系统：哺乳动物细胞瞬时 / 稳定表达

2. 启动子：CMV 强启动子，广谱高表达

3. 原核抗性：Kanamycin（卡那霉素），大肠杆菌扩增筛选

4. 真核筛选标记：Neomycin（Neo，G418 筛选），可构建稳转细胞株

5. 复制子：pUC 高拷贝复制子，质粒扩增产量高

6. 总长度：约 6.8 kb

二、DRP1 蛋白生物学功能（质粒核心靶点）

DRP1 是线粒体分裂唯一限速核心蛋白：

1. 静息状态：可溶性蛋白弥散分布于细胞质；

2. 分裂激活：被 MFF/FIS1/MiD49/51 招募至线粒体外膜，环绕线粒体形成环状寡聚体；

3. GTP 水解驱动环收缩，切断线粒体膜，完成分裂；

4. 生理意义：调控线粒体形态、线粒体自噬（mitophagy）、钙稳态、细胞凋亡、神经元发育；

5. 病理关联：帕金森、阿尔茨海默、心肌病、肿瘤均伴随 DRP1 异常活化 / 失活。

三、质粒核心用途（细胞成像为主）

1. 活细胞可视化线粒体分裂位点（最常用）

转染后红色荧光特征：

• 基础：胞质均匀弱红光；

• 分裂发生：线粒体膜上出现明亮红色点状聚集（DRP1 寡聚环）；共转绿色线粒体标记（Mito-GFP/Mito-BFP）可清晰共定位分裂缢缩位点，时间序列追踪线粒体动态裂变 / 融合全过程。

DRP1-mCherry细胞成像图

2. DRP1 蛋白亚细胞动态示踪

• 检测药物 / 基因干预后 DRP1 胞质→线粒体转位效率；

• 定量线粒体膜 DRP1 斑点数量、大小、荧光强度，量化线粒体分裂活性：

• WT mCh-DRP1 过表达：线粒体碎片化、小圆点状线粒体增多；

• K38A（GTP 失活突变）：DRP1 可定位但无法收缩，线粒体超长、高度融合（用于阴性对照）。

3. 多色共定位互作研究

搭配其他荧光质粒做多通路同步观测：

• 线粒体标记：Mito-GFP、Mito-BFP；

• 凋亡蛋白：BAX-GFP、Bim-CFP；

• ER 标记：Sec61-GFP（观测 ER - 线粒体接触位点与 DRP1 协同分裂）；

• 自噬标记：LC3-GFP（线粒体自噬过程 DRP1 动态）。

4. 稳定细胞株构建

G418 筛选获得持续表达 mCh-DRP1 的稳转细胞系，用于高通量药物筛选、长时程活细胞工作站观测。

5. 蛋白互作实验工具

可用于 Co-IP、荧光共振能量转移 FRET，检测 DRP1 与 MFF、MFN2、BAX 等分子相互作用。

四、野生型 vs 常见突变体质粒区别

表格

五、实验操作要点

1. 转染细胞：适用于 293T、HeLa、SH-SY5Y、心肌细胞、原代神经元等绝大多数哺乳细胞；脂质体转染 24–48 h 荧光最强；

2. 成像参数：mCherry 通道激发 570–590 nm，发射 600–640 nm；低激光功率减少光毒性，适合延时摄影；

3. 对照设置：

• 空白对照：未转染细胞；

• 荧光对照：单独 mCherry 空载（排除荧光蛋白本身影响线粒体形态）；

• 功能对照：K38A 失活突变质粒；

4. 注意事项：高剂量过表达 WT DRP1 会强制线粒体碎片化，实验建议低剂量质粒转染，避免人为干扰生理线粒体形态。

六、优势

1. 红色荧光与绿色 / 蓝色线粒体标记光谱完全分离，无串色，多色成像兼容性极佳；

2. mCherry 单体无聚集，不会人为造成 DRP1 假阳性点状聚集；

3. 原始文献出自顶刊 Science（2011），全球线粒体领域通用工具，数据认可度高；

4. 载体兼具瞬时表达与稳转筛选能力，适用场景广。

七、局限

1. 过表达外源 DRP1 会打破细胞内源融合 / 分裂平衡，需设置空载对照；

2. 荧光标签位于 N 端，极少数 DRP1 结合蛋白的 N 端互作位点可能轻微受干扰（可选用 C 端 DRP1-mCherry 变体规避）；

3. 仅适用于哺乳动物细胞，不直接用于酵母、果蝇（需对应物种 DRP1 载体）。