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一种简单、高产、高纯度荧光蛋白纯化方法
20年前，绿色荧光蛋白（GFP）仍被认为是产量较低，纯度较差，其纯化方法较为困难。McRae等报告一种高表达和高纯度纯化EGFP,EYFP，ECFP的方法：上清液中加入硫酸铵和TEA（Triethylamine），沉淀去除非目的蛋白后，再使用疏水层析柱纯化。
J.Youell等使用GST促溶标签融合表达EGFP，以及HRV-3C蛋白酶切除GST标签，EGFP产量达到50mg/L TY培养基（EGFP浓度以Bradford法测定）。
J. Scholz等为原核表达建立统一的SLIC法表达质粒平台，测试了以EGFP为目的蛋白，在不同融合标签下的表达量。主要标签为His6，His10，CBP,Onestrep,S-Tag，His6-GST，His6-SUMO3,TrxA,His6-MBP，NusA。其中NusA，TrxA，MBP融合标签的表达量最高。
SUMO以及SUMO3作为促溶标签的优势在于其相对于GST，TrxA等切除标签较为方便，且促溶效果明显，详细内容可见专利WO2003057174A2/US8119369B2。
西湖大学质粒共享平台表达一种EGFP衍生突变体mBaojin，所用质粒为pBAD-HisB-SUMO-MbaoJin，参考文献为Hanbin Zhang，2024。该质粒使用SUMO标签促溶，并在SUMO结构域C端以及融合蛋白终止子区域保留了限制酶切位点，以方便目的基因插入。
我们推荐以SUMO-EGFP方案表达纯化EGFP，能高效可溶表达，且纯化方法足够简单，仅用Ni柱即可纯化制备纯度至95%的目的蛋白。
EGFP蛋白表达方法
材料：
pET28a-6His-SUMO空载体（武汉开拓赛思生物技术有限公司）
EGFP基因序列（可从多种真核或原核表达质粒中克隆）
IPTG（生物技术级，国内多家供应商）
Ni-NTA（Ni-NTA Beads，6FF，国内多家供应商）
LB或TB培养基：本实验室自配。
卡那霉素：（25mg/mL储存母液）
SUMO Protease1(武汉开拓赛思生物技术有限公司，货号C119H，His标签版)
AKTA Pure
XK 16/20，XK26/20层析柱。
Part1：质粒构建
1.质粒构建以无缝重组方法进行，简要地，以pET28a-6His-SUMO质粒为模板，质粒经PCR线性化，切胶回收。EGFP基因片段以PCR扩增获得，切胶回收。
2.经无缝重组反应后，取5uL产物转化DH5a感受态。复苏1小时后，涂布Kan抗性平板，37℃过夜培养。
3.第二天挑取3-5个菌落，摇菌送一代测序验证。
4.剩余菌液提取质粒，备用。
Part2: 表达
1.经测序验证正确的质粒，取1uL转化BL21（DE3）感受态。复苏1小时后，涂布Kan抗性平板，37℃过夜培养。
2.挑取1-3个菌落，于50mL LB液体培养基，卡纳霉素终浓度25ug/mL，37℃振荡培养，过夜活化。
3.以1%(v/v)接种至TB培养基，卡纳霉素终浓度25ug/mL，37℃振荡培养。
4.3-4小时后，降低温度至20℃，加入终浓度0.2mM ITPG。
5.继续培养过夜。第二天离心收集菌体。
Part3 纯化
亲和层析：
1.冻存的菌泥解冻，并以1mL-1g比例加入亲和结合缓冲液NPI-10，悬浮，加入终浓度1mM PMSF。
2.超声破碎：工作3s，间歇6s，总工作时长30分钟。
3.4℃高速离心30分钟。
4.转移上清到新的容器，使用滤膜过滤，冰上放置。
5.XK16/20柱装填10cm高Ni填料，接AKTA Pure
6.使用NPI-10平衡层析柱5-10CV，样品上样于层析柱。
7.分步洗脱：10%,20%,100% NPI-250洗脱。
8.SDS-PAGE分析鉴定。
6His-SUMO标签切除以及反向Ni柱纯化
9.选择Ni柱洗脱产物，加入SUMO Protease1（酶：底物=1:100）。
10. 4℃酶切过夜，同时可透析至NPI-10，降低缓冲液中咪唑浓度。
11. 以NPI-10 平衡Ni柱5CV，将透析后样品上样于Ni柱。
12. 收集流穿。
13. 以NPI-250洗脱。
14. SDS-PAGE鉴定分析。
换液以及浓度测定、保存
15. 经SDS-PAGE鉴定后，将纯度符合要求的EGFP超滤换液至1×PBS。
16. Nanodrop 2000测定浓度（A280法）。
17. 调整至1mg/mL，分装，液氮速冻后，-80℃保存。
最终EGFP纯度鉴定：
参考文献：
1. Production and single-step purification of EGFP and a biotinylated version of the Human Rhinovirus 14 3C protease. James Youell, Daniel Fordham, Keith Firman. Protein Expression and Purification 79 (2011) 258–262
2. Rapid puriWcation of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity. Shelley R. McRae, Christopher L. Brown, Gillian R. Bushell. Protein Expression and PuriWcation 41 (2005) 121–127
3. Production and single-step purification of EGFP and a biotinylated version of the Human Rhinovirus 14 3C protease. James Youell , Daniel Fordham, Keith Firman. Protein Expression and Purification 79 (2011) 258–262
4. A new method to customize protein expression vectors for fast, efficient and background-free parallel cloning. Judith Scholz, Hüseyin Besir, Claudia Strasser and Sabine Suppmann. BMC Biotechnology 2013, 13:12
5. WO Patent:：WO2003057174A2
6. US Patent：US8119369B2
2026年06月21日
