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双萤光素酶报告基因解决方案--选择一个合适的载体组合（ pGL4系列 和 pNL 系列）
选择一个合适的载体组合
在 NanoLuc® 萤光素酶诞生以前，经典的萤光素酶双报告基因载体组合就是 Firefly 报告基因作为主报告基因，带组成型启动子的 Renilla 报告基因作为内参报告基因，NanoLuc ® 萤光素酶报告基因诞生后，增加了这种组合的可选择性：
注意： Renilla 和 NanoLuc® 不能作为双报告基因组合使用。
• 主报告基因载体的选择：如果是基因调控研究，需要选择不带启动子或其他调控元件的骨架载体，根据组合不同，可选择Firefly, NanoLuc® 中的任意一种。
• 内参报告基因载体的选择：带有表达组成型启动子的萤光素酶表达载体来作为内参，根据组合不同， 内参报告基因可以选择Firefly, NanoLuc® 或 Renilla 任意一种。推荐 pGL4 和 pNL 中带有不同强度的组成型启动子载体。
组合 | 主报告基因(含推荐载体举例) | 内参报告基因(含推荐载体举例) | 检测试剂 |
Firefly/Renilla | Firefly pGL4.10[luc2] Vector (Cat.# E6651) | Renilla pGL4.74[hRluc/TK] Vector (Cat.# E6921) pGL4.73[hRluc/SV40] Vector (Cat.# E6911) pGL4.75[hRluc/CMV] Vector (Cat.# E6931 ) | DLRTM (Cat.# E1910系列) Dual-Glo® (Cat.# E2920系列) |
NanoLuc®/Firefly | NanoLuc® pNL1.1[Nluc] Vector (Cat.# N1001) | Firefly pGL4.53[luc2/PGK] Vector (Cat.# E5011) pGL4.54[luc2/TK] Vector (Cat.# E5061) pGL4.13[luc2/SV40] Vector (Cat.# E6681) |
NanoDLRTM (Cat.# N1610系列) |
Firefly/NanoLuc® | Firefly pGL4.10[luc2] Vector (Cat.# E6651) | NanoLuc® pNL1.1.PGK[Nluc/PGK] Vector (Cat.# N1441) pNL1.1.TK[Nluc/TK] Vector (Cat.# N1501) pNL1.1.CMV[Nluc/CMV] Vector (Cat.# N1091) |
NanoDLRTM (Cat.# N1610系列) |
实验 Tips：
• 如果组合中使用 Nluc，则可以使用更高的报告基因载体用量比例，可能最高可以达到 1000:1 ( Fluc:Nluc )。
• 同一代的不同内参载体之间，最主要的区别是携带的启动子不同，包括 CMV 、SV40 、TK 等。通常，内参基因表达的活性应当显著的高于背景组，同时，尽量小，确保不干扰主报告基因的表达。所以，我们建议选择内参载体时，首先考虑活性较弱的 TK 启动子驱动的载体，启动子强弱见右图。如果通过文献资料或者预实验，发现该载体在目标细胞模型中表达效率过低，或者会受到实验研究因素干扰时，再考虑其他表达活性更强的载体（ 如 pGL4.75），或自己构建所需的特殊启动子载体。
• 如果萤光素酶表达量及信号强度满足要求的前提下，可选择快速应答报告基因载体，即萤光素酶基因与 PEST 失稳序列的融合（图 A），该融合缩短了萤光素酶的细胞半衰期（t1/2），防止了报告基因蛋白的积累，从而能够更快更灵敏的检测诱导反应（图B& C），更容易区别阳性和阴性信号。
