CRISPRi“三合一”混合慢病毒/质粒构建

CRISPRi（CRISPR interference） 是一种利用 CRISPR/Cas9 技术实现基因表达抑制（敲低）的方法，但不造成基因组DNA序列的改变。它依赖于一种被“失活”的 Cas9 蛋白（通常称为 dCas9，即 dead Cas9），该蛋白失去了切割DNA的能力，但仍能在 guide RNA（sgRNA）的引导下特异性地结合到靶基因的启动子或编码区附近，从而阻碍转录因子结合或RNA聚合酶的转录延伸，从而达到基因沉默效果。

CRISPRi 的核心组成：

· dCas9（失活型Cas9）：没有核酸酶活性，不切DNA，仅结合DNA。

· sgRNA：特异性识别靶基因的序列，引导dCas9定位。

· 转录抑制域（如KRAB/SDS3等）（可选）：与dCas9融合使用，加强沉默效果。

一、什么是CRISPRi“三合一”混合慢病毒？

CRISPRi 抑制慢病毒是一种将 CRISPRi系统的核心元件（如 dCas9-转录抑制域和sgRNA）封装进慢病毒载体并制备成病毒液的形式，用于稳定转导哺乳动物细胞，使目标基因长期被沉默。

CRISPRi“三合一”混合慢病毒是指将3条不同的sgRNA序列，均靶向同一个目标基因的不同区域（如启动子附近、转录起始位点等），同时封装进一支慢病毒液中，用于提高基因表达沉默的效率和稳定性。这是一种多sgRNA共包装的CRISPRi慢病毒产品，客户只需一次感染，即可实现多位点干扰，增强基因沉默效果。

二、什么是RNAi干扰“三保一”产品？

RNA干扰（RNAi）是一种由小分子RNA介导的基因沉默机制，主要通过siRNA或shRNA引导RNA诱导沉默复合体（RISC）与目标mRNA特异性结合并将其降解，从而阻断蛋白翻译，达到降低基因表达的目的。该机制具有高度特异性、不改变DNA序列、可逆性强等特点，广泛用于基因功能研究和疾病模型构建。

siRNA（small interfering RNA）：是双链RNA分子，通常由两个互补的短链RNA分子组成，长度约为20-25个核苷酸，一般siRNA可以通过化学方法合成，也可以由细胞内的Dicer酶作用在长的双链RNA前体上产生；siRNA可直接转染入细胞后短期发挥作用。

shRNA（short hairpin RNA）：是一个长链RNA分子，包含一个短的双链RNA部分，其余部分则形成一个单链的发卡结构；一般通过质粒或病毒载体在细胞内转录生成发夹状RNA，经过体内加工后实现持续敲低。

RNAi“三保一”产品是指：针对同一个靶基因设计3条不同的siRNA（或shRNA）序列，以单支产品的形式提供给用户,用户在一个实验中可同时使用这三条序列进行干扰，从而提高基因敲低效率与实验成功率，这是当前RNAi技术在科研领域常见的优化策略。

表1 “三合一”CRISRPi敲低慢病毒与“三保一”shRNA和siRNA敲低对比

三、为什么说CRISPRi慢病毒“三合一”会替代shRNA慢病毒和siRNA“三保一”？

1）在产品价格方面，虽然CRISPRi慢病毒在初始投入上略高于siRNA和shRNA（尤其是需引入dCas9表达系统），但其可建立稳定表达的细胞系，不需要反复构建或重复购买干扰试剂。粒曼团队为了全面赋能中国基础科研工作者，在“杞梓基金”支持下，基于高通量基因敲除数据平台优势以及全自动化载体构建及慢病毒包装生产线，极大降低成本，推动CRISPRi慢病毒在科研市场的应用。siRNA通常为一次性化学转染产品，需每次实验重复购买；shRNA虽可整合入基因组，但在干扰效率不理想时也常需更换多个序列尝试。CRISPRi通过三条sgRNA混合包装的“三合一”策略，在大幅提升敲低效率的同时，从长期来看大幅降低了单位有效实验的成本。

2）从干扰质量来看，CRISPRi具备更高的特异性与稳定性。其通过dCas9-转录抑制系统直接作用于目标基因启动子区域，阻断转录起始，避免了RNAi体系中由于过表达、RISC饱和等可能带来的脱靶效应和毒性问题。“三合一”CRISPRi病毒一次性混合三条sgRNA，显著提高敲低效率和稳定性，也增强了实验数据的重现性和可靠性。相比之下，shRNA和siRNA在不同细胞系中的沉默效率波动较大，且常受转染效率等因素影响。

3）在交付周期与效率方面，三合一CRISPRi慢病毒与shRNA病毒的构建周期相当（通常为7–15天），但CRISPRi一次筛选建株后即可反复使用，且无需反复优化序列；而siRNA产品虽交付快，但为一次性使用，需频繁重复转染，增加实验复杂度与时间投入。

综上所述，“三合一”CRISPRi敲低慢病毒在长期使用成本、基因敲低效果及实验效率等方面均优于传统的shRNA和siRNA敲低体系，是当前高要求基因功能研究中更具前景的选择。